贾赞慧,郑桂英,崔满华*,孙 琳,范艳艳

(1.吉林大学第二医院 妇产科,吉林长春130041;2.吉林大学化学系;3.吉林大学第一医院)

胰岛素样生长因子-1(IGF-1a)在多种肿瘤组织中均呈高表达状态,这种表达与肿瘤的分化程度、预后有关[1]。有学者研究发现,子宫内膜间质和腺上皮细胞合成和表达的IGF-1a参与子宫内膜的增生和分化以及淋巴转移[2]。在进行IGF-1a与子宫内膜癌发生发展关系研究过程中,需要提供大量IGF-1a蛋白质,本实验采用用分子克隆技术正确克隆及表达IGF-1a,为探讨其在子宫内膜癌发生、转移和治疗中的意义提供实验室基础,现将该基因的克隆、表达及纯化过程报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 NcoⅠ和 XhoⅠ内切酶购自TakaRa公司;Taq DNA 聚合酶 、dNTP、oligo-dT、10 ×PCR缓冲液、T4连接酶购自美国 Promega公司;RNase、卡那霉素及氨苄青霉素购于华美生物工程公司;IPTG购自Sigma公司。pET表达系统购自美国Novagen公司。pMD18-T vector购自TakaRa公司;大肠杆菌菌种BL21由本室保存。DNA marker购自华美生物工程公司,引物由上海生物工程公司合成。

1.2 pET28a-Cpn10-IGF-1a重组质粒的构建①IGF-1a基因的获取:用所合成的引物进行五重PCR扩增,五对引物为:第一对引物共设计5对引物,各对引物顺序均从 5'到3',第一对引物GCTCTTCACTTCGTGTGTCGACCGAGGGGCTTTTACTTC AACAAGCCCACAGGCTATG(58 bp)和CACTCATCCACAATCCCTGTCTGAGGTGCCCTCCGAATGCTGGAGCCA TAGCCTGTGG(58 bp);第二对引物CACTACAGCCGGACCAGAGACCCTTTGCGGGGCTGAGCTGGTGGATGCT CTTCACTTC( 58 bp)和CACAGTACATCTCCAGTCTCCT CAGATCACAGCTCCGGAAGCAACACTCATCCACAATC-(58 bp);第三对引物为CACACCTGTTCTACCTGGCGTCTGCTTGCTCACCTTCACCAGCTCCACTACAGCCCGG(58 bp)和GTTGGGCACGGATAGAGCGGGCTGCTTTTGTAGGCTTCAGTGGGGCACAGTACATCTC(58 bp);第四对引物CTGCCTCTGTGACTTCTTGAAGATAAAGATACACATCATGTCGTCTTCACACCTGTTC(58 bp)和TTCAAATGTACTTCCTTCTGAGTCTTGGGCATGTCAGTGTGGCGTTGGGCACGGATAG (58 bp);第五对引物CCATGGGGAAAATCAGCAGCCTTCCAACTCAATTATTTAAGATCTGCCTCTGTGAC(56 bp)和CTCGAGCATTC-TGTAGGTCTTGTTTCCTGCACTTCCTCTACTTGTGTTCTTCAAATGTACTTC(63 bp)。②pET28a-Cpn10-IGF-1a重组质粒的获得:将PCR扩增出的产物片段以NcoI和XhoI切点定向克隆入pET28a表达质粒,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)。取经卡那霉素平板筛选的阳性转化菌培养,提取质粒。采用相同酶切后,用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆。然后由上海生物工程公司对重组质粒进行测序鉴定。……