方 敬， 陈志强， 范焕芳， 闫翠环

（河北医科大学中西医结合研究所，河北石家庄 050017）

系膜增生性肾小球肾炎（MsPGN）是一种免疫介导的炎症反应性疾病，是指以肾小球系膜细胞增生和细胞基质积聚为主要病理改变的一类肾小球疾病［1］，近几年国内有报道，青藤碱可以减轻肾小球炎症反应的作用，并且副作用小，没有肝损害。本实验旨在通过观察青藤碱对MsPGN大鼠肾脏病理形态学及肿瘤坏死因子－a（TNF－a）表达的影响，探讨青藤碱在MsPGN病理过程中的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 成年♂SD大鼠，体重（130±170）g，共40只，由河北医科大学实验动物中心提供，合格证号:冀医动管字第04057。

1.2 试剂 兔抗大鼠TNF－a多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）;SP（二抗为羊抗兔）试剂盒（北京中山生物技术有限公司）。TNF－a引物上游:5’－GTC GTA GCA AAC CAC CAA G－3’，下游 5’－GTC GTA GCA AAC CAC CAA G－3’，（北京赛百盛工程技术服务有限公司）。

1.3 模型制备 动物随机分为4组，每组10只，分别为正常组、模型组、青藤碱组、雷公藤多苷组，采用改良的慢性血清病性MsPGN模型，10%的水合氯醛麻醉后，经背部切除左侧肾脏，在每只大鼠背部皮下分点注射完全弗氏佐剂0.1 mL加BSA 3 mg，于第1、2周末背部皮下注射不完全弗氏佐剂0.1 mL加BSA 3 mg，3周后腹腔注射BSA连续4次，每次间隔 1 h，注射剂量每只分别为0.5、1、1.5、3.0 mg，次日每只腹腔注射BSA 2 mg。第4周正式免疫:尾静脉与腹腔注射隔日进行，每只大鼠尾静脉注射BSA剂量从0.5 mg开始，每次增加0.5 mg，至2.5 mg为止，继续每周加量0.5 mg，至每日用量5 mg为止，腹腔注射量是尾静脉注射量的1倍，至每日用量10 mg为止，免疫两周后尾静脉注射大肠杆菌内毒素（LPS）100 μg/只，全部大鼠于正式免疫8周后处死取肾组织。

1.4 实验用药及方法 采用直接灌胃方法，于实验第4周开始灌胃给药，每日1次，青藤碱组采用正清风痛宁（白云山正清制药股份有限公司 批号:9911105），服药量为30 mg/（kg·d），按成人/（kg·d）剂量的15倍给药;雷公藤多苷（TWP）组采用雷公藤多苷片（湖南省株洲市制药三厂 批号:Z43020138）服药量为20 mg/（kg·d），按成人/（kg·d）剂量的15倍给药，正常组灌以相应量的自来水。各组灌胃共4周。

1.5 肾组织标本制作及观察

1.5.1 光镜 实验第8周末，无菌下取右肾组织，HE、PAS染色，镜下观察并拍片。

1.5.2 免疫组织化学染色 采用SP法观察肾小球中TNF－a的变化，并进行半定量分析。肾小球内表达:采用HMIAS－2000型高清晰度彩色病理图象分析系统，每组选取6只大鼠标本，每个标本测量10个完整肾小球进行半定量分析。肾小管的表达:选用标本数及分析系统同上。检测每张切片10个视野，计算每个视野阳性染色面积以及显示屏面积，阳性染色面积和显示屏面积的比值表示相对含量。

1.5.3 逆转录－多聚酶链反应（RT－PCR） 引物的设计与合成:TNF－α、内参照β－actin的引物设计用PrimerPremier5.0引物设计软件自行设计完成，由北京赛百盛生物工程公司鉴定并合成。TNF－α的上下游引物序列分别为5’－GTC GTA GCA AAC CAC CAA G－3’，5’－GTC GTA GCA AAC CAC CAA G－3’，扩增的基因片段长度为214 bp。混匀，8 000 r/min离心30 s。PCR仪目的基因和内参照同管扩增，反应条件:以95 ℃预变性10 min，95 ℃35 s，54 ℃退火35 s，72 ℃35 s，30循环，72℃延伸10 min。各组 PCR产物20 μl，gold view染色，2%琼脂糖凝胶电泳，经凝胶图像定量分析系统成像，以β－actin为内参照，应用读胶仪读取各条产物带的光密度值，并计算产物的相对表达量。

1.6 统计学处理 使用SPSS11.5 for windows统计软件，所有数据均用均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析法对实验结果进行统计学分析。

2 结果

2.1 光镜观察结果 正常组肾小球结构正常，肾小球毛细血管腔开放，系膜区的宽度小于血管直径，肾小管、间质无异常。模型组肾小球系膜区明显增宽，系膜基质增多，肾小球毛细血管腔受压变窄或闭塞。部分肾小管上皮细胞肿胀、管腔狭窄，间质有炎细胞浸润。青藤碱组和雷公藤多苷组肾小球系膜区的宽度明显小于模型组，其宽度等于或小于毛细血管腔直径，肾小球毛细血管腔呈开放状态。

2.2 免疫组化检验结果（表1） 正常组肾组织中肾小管仅呈微弱阳性反应，肾小球呈阴性反应;模型组在肾小球及肾小管中分布的范围和强度明显扩大和增强;青藤碱组表达明显降低（与模型组P＜0.01），两治疗组相比无统计学意义（P＞0.05）

表1 免疫组化检验结果（±s）

表1 免疫组化检验结果（±s）

与模型组比较，##P＜0.01。

组别 样本数/个 肾小球 肾小管正常对照组模型组青藤碱组雷公藤多苷组6666 1.09±0.27 10.03±2.99 4.52±0.64##4.68±0.55##1.11±0.50 12.11±3.76 5.74±1.38##5.32±1.11##

2.3 RT－PCR结果（表2） 各组肾组织的TNF－αmRNA PCR产物电泳条带则显示不均一。正常组有基础水平的TNF－αmRNA表达。提示MsPGN大鼠TNF－αmRNA表达存在明显的上调。青藤碱组和雷公藤多苷组TNF－αmRNA表达明显下调（与模型组P＜0.01），提示青藤碱可以抑制肾组织TNF－αmRNA的表达。两治疗组相比无显著差异（P＞0.05）

表2 肾组织TNF-αmRNA的表达（±s）

表2 肾组织TNF-αmRNA的表达（±s）

与模型组比较，#P＜0.05 ##P＜0.01。

组别 样本数/个 TNF－α 0.32±0.02模型组 6 0.81±0.02青藤碱组 6 0.77±0.03#雷公藤多苷组 6 0.76±0.04 mRNA/%正常对照组6##

3 讨论

我们选用邹氏造模法并进行改良制备MsPGN模型［2］，实验结果表明，青藤碱可以抑制肾小球系膜细胞增殖，系膜基质积聚，延缓病变进展，其作用机制可能与该药抑制TNF－a的表达有关。

TNF－a可以通过多种途径作用于系膜细胞。首先TNF－a促进系膜细胞主要组织相容性抗原Ⅰ和Ⅱ表达，促进5’－核苷酸、促凝血物质，糖蛋白合成;TNF－a与IL－1协同作用在转录和翻译水平刺激系膜细胞合成前列腺素和花生四烯酸，增强磷脂酶A活性，增强环氧化酶活性，使MC增殖、基质增宽［3］;而且 TNF－a诱导系膜细胞产生血小板活化因子（PAF）［4］，影响肾脏血液循环的同时，也可改变肾小球系膜细胞的功能，使其发生细胞收缩，导致细胞形态和细胞骨架改变，刺激系膜细胞分裂增殖。此外，TNF－a本身的毒性作用可以造成系膜细胞变性及坏死性改变。

综上所述，青藤碱通过下调TNF－a及TNF－amRNA的表达，从多种途径作用于系膜细胞，改善MsPGN大鼠肾脏病理改变，延缓肾小球硬化。

［1］Nagler Aron，Helena Aingon A.Inhibion of glomerular mesangial cell proliferation and extracellular matrix deposition by halafuginone［J］.Kindey Int，1997，52:1561.

［2］贾 慧，邹万忠.改良慢性血清病性大鼠系膜增生性肾炎模型的建立［J］.肾脏病与透析肾移植杂志，1996，5（3）:21－25.

［3］Watanabe K，Nakagawa H.Cytokines enhance the production of a chemotactic factor for polymorphonuclear leukocytes by rat venal glomerular epit helioid cells［J］.Nephron，1990，54:169.

［4］Camussi G，Turello E，Tetta C，et al.Tumor necrosis factor induces contraction of mesangial cells and alters their cytoskeletons［J］.Kidney Int，1990，38（5）:795－802.