冯素香， 王淑美， 梁生旺， 李建生

（1.河南中医学院，河南郑州 450008;2.广东药学院，广东广州 510006）

脑脉通由大黄、葛根、人参等药物组成，具有解毒降浊、益气活血作用，治疗老年脑梗死具有明显效果，对脑缺血再灌注损伤有明显保护作用［1］。中药复方是由多种中药材组成的，复方中药与各味原药材的成分之间一定存在着相关性。中药指纹图谱是用于中药质量控制的标准之一，在指纹图谱研究中研究复方中药与中药材的相关性，有利于制定科学的复方中药质量控制方法。本研究采用HPLC-PDAD联用方法，建立了脑脉通有效部位HPLC指纹图谱，并对有效部位化学成分指纹图谱色谱峰的归属进行了研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-2010A高效液相色谱仪（日本岛津），SPDM10Avp二极管阵列检测器（日本岛津）;BSZZ4S型电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

1.2 试药 乙腈为色谱纯;纯净水，磷酸、乙醇、正丁醇等试剂均为分析纯。

大黄、人参、葛根等药材购自河南省药材公司，经河南中医学院陈随清教授鉴定分别为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatumL.的干燥根及根茎、五加科植物人参Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根、豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根。脑脉通有效部位样品（自制）。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

按处方量称取葛根、大黄、人参等药材，用70%乙醇提取两次，每次1 h，回收乙醇至无醇味，水溶液过大孔吸附树脂柱，先用蒸馏水洗至无色，再用低浓度乙醇洗去杂质，继用A%浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇至干，并于60℃低温烘干，即得到有效部位（此部位是经药效学实验筛选出来的）［2，3］。

取有效部位样品0.3 g，精密称定，加水20 mL超声使溶解，转移至分液漏斗中，用水饱和正丁醇提取4次（20，20，15，15），合并正丁醇液，水浴上蒸干，残渣加甲醇使溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，作为有效部位供试品溶液。

药材供试品溶液的制备:按处方量分别称取各药材，按有效部位相同制备方法处理。

阴性复方供试品溶液的制备:按处方量称取除某味药的阴性处方，按复方相同制备方法处理。

2.2 色谱条件

色谱柱:Sinochrom ODS-BP C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）（大连依利特）;流动相:乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）梯度洗脱（B%为96→90→80→60→96，相应时间周期为0→60→80→120→140 min）;流速:1.0 mL/min;检测波长:203 nm;柱温:30℃。吸取供试品溶液10 μL注入液相色谱仪，测定120 min的色谱图。

2.3 方法学考察［4］

2.3.1 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，按上述色谱条件注入液相色谱仪，连续进样6次，在203 nm波长进行检测，记录各色谱峰的保留时间和峰积积分值，计算各共有峰相对参照峰（8号色峰）的相对保留时间和相对峰面积。结果，共有峰相对保留时间的RSD为0～1.91%，相对峰面积的RSD为0～2.69%。结果表明，仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，按上述色谱条件分别在制备后 0、3、6、9、12、18、24 h 进样，记录各色谱峰的保留时间和峰面积积分值，计算各共有峰相对参照峰（8号色峰）的相对保留时间和相对峰面积。结果，共有峰相对保留时间的RSD为0～1.72%，相对峰面积的RSD为0～1.84%。结果表明，供试品溶液在24 h检测时间范围内基本一致，表明样品溶液在24 h内基本稳定。

2.3.3 重复性试验 取同一批样品，按供试品方法重复制备6个供试品溶液，精密吸取供试品溶液各10 μL，按上述色谱条件分别进行测定，记录各色谱峰的保留时间和峰面积积分值，计算各共有峰相对参照峰（8号色峰）的相对保留时间和相对峰面积。结果，共有峰相对保留时间的RSD为0～1.86%，相对峰面积的RSD为0～2.42%。结果表明重复性基本符合指纹图谱要求。

2.4 有效部位指纹图谱的建立及特征峰的标定

按上述方法制备供试品溶液，按上述梯度洗脱条件进行色谱分析，获得全方有效部位以及组方药材的指纹图谱。经比较，全方有效部位在203 nm标注了36个共有色谱峰作为可以构成有效部位指纹图谱的稳定特征峰（指纹图谱见图1）。其中0～24 min主要为未知小峰，tR=25.16 min最高峰为葛根素色谱峰，25～30 min为葛根中黄酮类成分，在203 nm检测波长下22号峰为人参皂苷Rg1，其后面的肩峰为人参皂苷Re，31号峰为人参皂苷Rb1。其它色谱峰多来源于大黄中成分。各药材相应部位的指纹图谱见图2。

图2 药材HPLC图谱（203 nm）

2.5 有效部位与药材指纹图谱相关性分析

分析大黄药材的供试品与有效部位色谱图，其中有5个保留时间一致和紫外吸收光谱图很相似的色谱峰（见图3）;人参药材的供试品与有效部位有3个保留时间一致的色谱和紫外吸收光谱图很相似峰（见图4）;葛根药材的供试品与有效部位有5个保留时间一致的色谱和紫外吸收光谱图很相似峰（见图5）。

图3 有效部位与大黄药材图谱（203 nm）（A有效部位 B大黄阴性 C大黄药材）

图4 有效部位与人参药材图谱（203 nm）（A有效部位 B人参阴性 C人参药材）

图5 有效部位与葛根药材图谱（203 nm）（A有效部位 B葛根阴性 C葛根药材）

综合有效部位与各原药材的相关性研究，在203 nm波长检测下共找出与原药材色谱峰保留时间一致的色谱峰14个。见表1。

表1有效部位与各原药材指纹图谱中对应峰（203 nm）

研究结果表明，有效部位成分主要来自人参、葛根和大黄等三味药材，含有葛根素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1等成分，含量测定分析结果显示，有效部位中黄酮类、皂苷类和蒽醌类占主要部分［5，6］。

3 讨论

3.1 洗脱条件的选择 脑脉通有效部位中含有多种化学成分，如葛根中黄酮类成分、人参中皂苷类成分、大黄中蒽醌类成分等多种活性物质，成分较为复杂，很难找到较为理想的等度洗脱条件。研究中我们分别采用了乙腈-水、乙腈－0.01%磷酸水、乙腈－0.05%磷酸水、乙腈－0.1%磷酸水等多种不同浓度和比例的等度及梯度洗脱条件进行了试验，结果发现采用乙腈－0.1%磷酸水进行梯度洗脱，各色谱峰分离结果良好。

3.2 检测波长的选择 人参中皂苷类成分为末端吸收，故选取203 nm作为测定波长，在此条件下能全部表达脑脉通有效部位中全部化合物的色谱峰;同时各组分也可以得到较好的分离。

3.2 参照物的确定 脑脉通处方由葛根、大黄、人参、川芎等药材组成。其中人参中人参皂苷紫外吸收为末端吸收，灵敏度较低;主要鉴于指纹图谱的目的是甄别原料和药品的真伪，为此，我们认为选定葛根中含量高、灵敏度高的葛根素为本指纹图谱技术要求的参照物，葛根素也是中国药品生物制品检定所确认的黄酮苷类标准物质之一。

3.3 组方药材与有效部位相关性的分析 本论文研究脑脉通有效部位与各味药材相关性的方法是:在同一色谱条件下分析有效部位、药材、部分对照品及阴性对照色谱图，如果某色谱峰在药材色谱图中出现，而在阴性对照色谱图的对应保留时间上缺失，则提示该色谱峰来源于该药材;如果该色谱峰在有效部位色谱图中也同时出现，且来自于有效部位的某色谱峰与某原药材的色谱峰的紫外吸收光谱相似，即表示有效部位中的这个色谱峰就来自于这味药材。采用对照品对色谱图中的有关峰进行了指认。

通过对脑脉通有效部位指纹图谱与各药材相应部位指纹图谱的相关性分析，阐明了有效部位中主要指纹峰的来源。本研究结果将为脑脉通新药研发的工艺和质控研究奠定了基础，充分显示出色谱指纹图谱技术在中药分析质控难题的核心技术应用前景。

［1］任小巧，李建生，封银曼，等.脑脉通对老龄大鼠脑缺血/再灌注损伤脑保护作用的研究［J］.中国中药杂志，2004，29（1）:66-68.

［2］王淑美，冯素香，郭亚健，等.脑脉通不同提取工艺中蒽醌类化学成分变化的研究［J］.中成药，2007，29（4）:511-515.

［3］王淑美，冯素香，梁生旺，等.反相高效液相色谱法测定脑脉通有效部位中蒽醌类成分的含量［J］.中国新药与临床杂志，2007，26（3）:171-174.

［4］国家药品监督管理局.中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）［J］.中成药，2000，22（10）:391.

［5］王淑美，李淑芳，梁生旺，等.AB-8大孔吸附树脂纯化复方脑脉通有效部位的工艺研究［J］.中成药，2009，31（1）:47-50.

［6］王淑美，冯素香，李淑芳，等.脑脉通有效部位中总蒽醌的含量测定［J］.广东药学院学报，24（2）:128-129.