索银科， 王永平

（1.宝鸡市药品检验所，陕西宝鸡 721001;2.中铁一局集团中心医院，陕西华县 714100）

退热解毒注射液由金银花、连翘、牡丹皮、蒲公英、金钱草、柴胡、夏枯草、石膏共八味药材组方，具有清热解毒的功能［1］。绿原酸和咖啡酸具有抗病毒、抗菌、利胆、止血等药理作用［2］。蒲公英、金银花中均含有绿原酸和咖啡酸［3，4］，文献中报道分析方法较多［5-7］，但尚未见同时测定退热解毒注射液中的此两组分。部颁标准采用高效液相色谱法只测定该制剂中的绿原酸［1］，本试验采用高效液相色谱法同时测定了绿原酸和咖啡酸的含量，样品不需要特殊处理，具有简便、准确、无干扰的特点。

1 仪器与试药

Agilent 1100 Series高效液相色谱仪（单元泵G1310A，VWD 检测器 G1314A，7725i进样阀 G1328B，20 μL 定量环，Agilent Chem Station revision B.02.01-SR1［260］）;TU-1901紫外可见分光光度计;绿原酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号:110753-200413，供含量测定用）和咖啡酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号:110885-200102，供含量测定用）;退热解毒注射液市售品为陕西某制药企业产品3批（批号080417，080717，080718）;甲醇（HPLC，天津市科密欧试剂有限公司）;重蒸馏水;其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Hypersil ODS色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;柱温:30 ℃;流动相:0.01 mol/L 磷酸二氢钠溶液（1%磷酸溶液调节pH值至3.9）-甲醇（85∶15）;流速:1.0 mL/min;检测波长:323 nm;进样量:20 μL。

2.2 对照品溶液制备 精密称取经减压干燥（真空度0.075 MPa，温度20℃，干燥剂五氧化二磷）24 h的绿原酸对照品20.0 mg、咖啡酸对照品8.0 mg，分别置50 mL量瓶中;用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即分别得浓度为400 mg/L的绿原酸和160 mg/L的咖啡酸对照品溶液。

2.3 样品溶液制备 取5支注射液，混匀，精密量取1.0 mL，置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4 阴性样品溶液制备 按处方称取除金银花、蒲公英外各味药材相当10mL量，照退热解毒注射液生产工艺制备阴性样品，精密量取1.0 mL，置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

2.5 方法的专属性 在拟定的色谱条件下测定，吸取40 mg/L绿原酸、20 mg/L咖啡酸对照品溶液、样品溶液和阴性样品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图见图1。对比保留时间可知，保留时间为11.325 min和25.013 min分别是绿原酸峰和咖啡酸峰，经计算其理论板数分别为863和5 276，二者与相邻峰的分离度为6.34和9.36，阴性样品溶液色谱图显示在绿原酸和咖啡酸峰位置处无干扰，表明其他组分和辅料不影响对二者同时测定。

图1 绿原酸对照品（A）、咖啡酸对照品（B）、样品（C）和阴性样品（D）的HPLC色谱图

2.6 线性关系考察 分别精密量取400 mg/L绿原酸对照品溶液0.01、0.1、0.3、1.0、3.0、5.0 mL 和 160 mg/L 咖啡酸对照品溶液 0.01、0.06、0.6、2.0、5.0、10 mL，依次分别置 10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，制成表1所示浓度的绿原酸和咖啡酸对照品溶液，精密吸取上述各溶液20 μL，按上述色谱条件进行测定，分别以绿原酸和咖啡酸对照品溶液（X:mg/L）为横坐标与其相应的峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，结果见表1。测得绿原酸、咖啡酸检测限（S/N=3）分别为0.013，0.005 mg/L;定量限（S/N=10）分别为0.040，0.016 mg/L。

表1 绿原酸和咖啡酸标准曲线

2.7 稳定性试验 精密吸取同一批号的退热解毒注射液样品溶液，分别在 0、0.5、1、2、4、12 h 时测定，结果绿原酸、咖啡酸的峰面积RSD值分别为1.4%和1.6%，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.8 精密度试验 取同一批号的退热解毒注射液样品溶液，精密量取20 μL，连续进样5次，结果绿原酸、咖啡酸的峰面积RSD值分别为1.2%和1.4%，表明该方法精密度良好。2.9 重复性试验 取批号080417退热解毒注射液，按2.3项制备供试品溶液5份，精密量取20 μL，各溶液进样分析2次，以平均峰面积按标准曲线法计算，测得绿原酸和咖啡酸含量分别为1.5 mg/mL（RSD为1.4%，n=5），0.13 mg/mL（RSD为1.7%，n=5）。

2.10 加样回收率试验 精密量取本品1.0 mL，置25 mL量瓶中，分别精密加入表2所示量绿原酸和咖啡酸对照品溶液，用流动相定容至刻度，摇匀，作供试液。吸取20 μL进样分析2次，记录色谱图，以平均峰面积按标准曲线法计算，测得绿原酸和咖啡酸平均回收率分别是99.4%（RSD=1.0%），100.9%（RSD=1.6%）。见表2。

表2 绿原酸和咖啡酸的回收率（n=6）

2.11 样品含量测定 取5支注射液，混匀，精密量取1.0 mL，置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得供试液。精密吸取20 μL进样分析2次，记录色谱图，以平均峰面积按标准曲线法计算样品中绿原酸与咖啡酸含量。重复实验2次，样品测定结果见表3。

表3 样品中绿原酸和咖啡酸含量（n=3）

3 讨论

3.1 咖啡酸在323 nm处有最大吸收，绿原酸在327 nm处有最大吸收。考虑供试品咖啡酸含量较低，所以选用323 nm为检测波长，此波长下绿原酸吸光度也较大。

3.2 本试验进行了两味药材阴性对照试验，证实此两味药之间无相互干扰。实验中各样品均用流动相稀释，消除了溶剂峰干扰。

3.3 考察了水-甲醇-乙腈-冰醋酸、甲醇-磷酸水溶液、甲醇-磷酸盐缓冲液等流动相，最终确定甲醇-磷酸二氢钠溶液（pH值为3.9）（15∶85），流速:1.0 mL/min，分离效果良好，绿原酸、咖啡酸分别在11 min、25 min左右出峰，保留时间适中，重复性好，回收率高，可用于退热解毒注射液的质量控制。

［1］卫生部药品标准中药成方制剂［S］.第20册.1998:250-251.

［2］国家医药管理局中草药情报中心站.植物药有效成分手册［M］.北京:人民卫生出版社，1986:159-161，209-210.

［3］肖培根，李大鹏，杨世林.新编中药志［M］.第三卷.北京:化学工业出版社，2002:363-373.

［4］肖培根，李大鹏.新编中药志［M］.第五卷.北京:化学工业出版社，2007:988-995.

［5］中国药典［S］.一部.2005:152-153，244-245.

［6］孙国祥，刘唯芬，朱澄云，等.RP-HPLC测定射干抗病毒注射液中绿原酸和咖啡酸含量［J］.中成药，2006，28（7）:962-965.

［7］李喜凤，师绘敏，陈随清，等.HPLC同时测定蒲公英中绿原酸和咖啡酸的含量［J］.中成药，2008，30（10）:1553-1555.