万志敏， 许沛虎， 张雪琼， 靳文运， 朱中佳

（武汉理工大学化工学院，湖北武汉 430070）

草木犀为豆科（Legum ino sae）草木犀属（Melilotus Mill.）一年或两年生草本植物，该属植物全世界约有20种，其中黄花草木犀主要分布于温带、亚热带、欧亚大陆及地中海地区，是家畜重要的优质牧草之一，同时民间以叶、花制成软膏，用作外伤药;或煎服用于治疗浮肿、腹痛、疟疾等症。具有止咳平喘、清热解毒、解痉止痛、化湿和中的功效。我国《部颁标准》、《藏药标准》和《上海市药材标准》有所收载。本实验主要以总香豆素含量为指标，对大孔树脂的种类及相应的纯化工艺进行筛选，为确定生产工艺参数提供依据。

1 材料与装置

UV1101型紫外分光光度仪（上海天美科学仪器有限公司）;BS－124S电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）;DW－2控温电热套（江苏通州光学仪器有限公司）;水浴锅（余姚市亚星仪器仪表有限公司）;SZ－93自动双重水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）;ZK－40AX电热真空干燥箱（上海申光仪器仪表有限公司）;

黄花草木犀购自宁夏绿博种子公司;D101－1树脂（药用级）;NKA－9树脂（药用级）;AB－8树脂（药用级），以上树脂均购自天津海光化工有限公司;蒸馏水实验室自制;香豆素对照品（购自成都曼斯特生物科技有限公司，A1079 Coumarin HPLC≥98%）;乙醇、NaOH均为AR级。

2 方法及结果分析

2.1 草木犀总香豆素的测定 精密称取香豆素对照品5.2 mg，置25 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL置10 mL量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，得到浓度为0.020 8 mg/mL的标准品溶液。从中量取1、2、3、4、5 mL分别定容至10 mL量瓶中。以乙醇为空白对照，在275 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准曲线，得线性回归方程Y=80.865X+0.001，R2=0.999 3表明香豆素在0.002 08～0.010 4 mg/mL与吸光度线性关系良好。

2.2 上柱液的制备 称取草木犀药材100 g，加500 mL 95%乙醇回流提取3 h，提取液回收至无乙醇味，加水定容至1 000 mL，超声处理30 min，使其分散均匀，即得。

2.3 不同吸附树脂对草木犀总香豆素的静态吸附量试验

精密称取已处理好的干树脂约1 g，置100 mL烧杯中，加草木犀样品溶液（质量浓度1.66 mg/mL）20 mL，每隔10 min振摇20 s，持续3 h，然后静置24 h，使其达到饱和吸附，吸取上层液测定总香豆素的质量浓度。按下式计算树脂饱和吸附量:饱和吸附量=

结果见表1。

表1 3种树脂静态饱和吸附量测定结果（n=3）

2.4 不同树脂对草木犀总香豆素静态吸附－洗脱性能试验

结果见表2。

表2 3种树脂静态洗脱测定结果（n=3）

结果说明除NKA－9对草木犀总香豆素的静态吸附量较小外，另外两种树脂的吸附量均在28.5 mg/g以上，能用于草木犀总香豆素吸附分离工艺。在静态洗脱中，D101－1型树脂吸附的草木犀总香豆素较易洗脱，AB－8型树脂的洗脱率相对较低，D101－1型树脂表现出最佳的综合性能。因而选用D101－1型树脂分离纯化草木犀总香豆素。

2.5 D101－1树脂对草木犀总香豆素的动态吸附性能与最大上样量的考察 将浓度为0.1 g/mL的样品液以1.0 mL/min的流速通过树脂柱（树脂干重为6 g，径高比1∶7），分段收集残留液，测定总香豆素含量，结果见表3。

表3 最大上样量考察结果

动态吸附性能考察结果:从泄露曲线可得第8流份残留液中总香豆素明显增多，说明上样至第7流份时总香豆素开始明显泄露。故确定草木犀样品液的最大上样量为5 g生药/g干树脂。

图1 草木犀泄漏曲线

2.6 去杂溶剂种类与去杂性能的考察 分段（每段50 mL）收集蒸馏水、10%乙醇、20%乙醇的去杂洗脱液（上样流速为1 mL/min，径高比1∶7），测定其不同流份的总香豆素浓度，结果见表4，并绘制去杂曲线，见图2。

表4 去杂溶剂种类考察结果（n=3）

图2 不同去杂溶剂的去杂曲线

由去杂曲线可知，蒸馏水和10%乙醇洗脱液中草木犀总香豆素较少，当乙醇浓度增大到20%时，总香豆素损失明显，又因为10%乙醇极性与树脂极性更相似，故其去杂能力更强，所以确定300 mL10%乙醇为去杂溶剂（第6流份洗脱液基本为无色，故确定去杂溶剂体积为300 mL）。

2.7 洗脱剂种类与洗脱性能的考察 分段（每段50 mL）收集含0.5%NaOH的10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇的洗脱液（上样流速为1 mL/min，径高比1∶7），用稀盐酸调节pH值至3～4，测定其不同流份的总香豆素浓度，结果见表5，并绘制洗脱曲线，见图3。

表5 洗脱溶剂种类考察结果（n=3）

图3 不同洗脱剂的洗脱曲线

含0.5%的乙醇溶液解析能力较强，当乙醇浓度达30%时解析比较充分，因此选其为洗脱剂，又因为从第4流份开始，解析的总香豆素明显减少，故洗脱剂的用量为200 mL。2.8 验证性实验 取草木犀药材粉末30 g，500 mL95%乙醇回流提取3 h，过滤，滤液回收乙醇至无乙醇味，加水定容至300 mL，将已处理好的6 g D101－1型大孔树脂装柱，以1.0 mL/min的流速将300 mL草木犀上柱液上大孔树脂柱，静置吸附30 min，后用300 mL10%乙醇以1.0 mL/min的流速去杂，弃除杂液，再用200 mL含0.5%NaOH的30%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，用稀盐酸调pH值至3～4，回收乙醇，真空干燥得黄棕色粉末，后用无水乙醇洗涤，回收乙醇，真空干燥得产物为深棕色粉末，平行实验3份，结果见表6。

表6 验证性实验结果（n=3）

经验证实验，RSD＜2%，工艺稳定可行。

3 讨论

草木犀主要抗炎活性成分为香豆素类物质，香豆素的α－吡喃酮环具有α－β－不饱和内酯性质，在稀碱液中渐渐水解成黄色溶液，生成顺式邻羟桂皮酸（coumarinic acid）的盐。其盐的水溶液一经酸化即闭环恢复为内酯。在这一过程中香豆素的分子形态发生变化，分子极性发生显著改变，结合大孔树脂分离纯化原理设计本实验纯化工艺，通过改变洗脱溶剂的pH值，使吸附在大孔树脂上的香豆素转变为顺式邻羟桂皮酸形态，大孔树脂对顺式邻羟桂皮酸的吸附能力变弱，故30%的乙醇即可很好解吸，通过调节洗脱液的pH值，可使顺式邻羟桂皮酸恢复到香豆素形态，即达到了纯化目的，此方法为香豆素类物质的纯化提供了一个新思路。

又因为顺式邻羟桂皮酸不容易游离存在，长时间碱液中放置或UV照射可转为稳定反式邻羟桂皮酸，反式邻羟桂皮酸在酸性环境中不易闭环恢复为内酯，故解吸后的洗脱液因尽快调节pH值至3～4，同时实验应在避光处进行。

［1］吴立军.天然药物化学［M］.北京:人民卫生出版社，2003:110－120.

［2］陶君彦，冯其麟，张宝徽，等.草木犀药材中香豆素类化合物提取分离纯化研究［J］.中国医院药学杂志，2008，28（14）:3711－7711.

［3］石忠蜂，陈蔚文，李卫民，等.大孔吸附树脂纯化黄芪总皂苷的研究［J］.中草药，2005，36（9）:2231－5231.

［4］何芳辉，尹蓉莉，刘 扬，等.大孔树脂纯化白芷总香豆素工艺研究［J］.时珍国医国药，2008，19（3）:710－712.

［5］张新勇，向仁德，张根元.酸碱法提取蛇床子总香豆素的工艺研究［J］. 中成药，1999，21（1）:7－8.