陈 悦，徐 晓，鲁 颖

(河南大学医学院生理学教研室，开封 475004)

葛根系豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根，葛根素(puerarin，Pur)是从其干燥根中分离出来的单体，化学名为4，7-二羟基 8-β-D 葡萄糖异黄酮(4H-1-Benzopyran-4-one，8-B-D-glucopyranosyl-7-hydroxy 3-4-hydroxyphenyl)。由于其化学成分具有独特的生物活性，备受医学界关注。Pur对心血管系统的作用已经得到证实[1]，但Pur究竟是通过何种途径发挥作用，具体机制尚未完全明了。本实验用常规微电极方法和全细胞膜片钳技术，观察并记录葛根素对大鼠心室肌动作电位和心室肌细胞钾离子流的影响，以探讨Pur抗心律失常的电生理机制。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂

体重200～230g大鼠，雌雄不限，郑州大学实验动物中心提供。台氏液成分(mmol/L):NaCl 143.0，KCl 5.4，CaCl21.8，MgCl20.5，NaHCO323.8，NaH2PO40.3，glucose 10，95%O2和5%CO2饱和，pH 7.3。无钙台氏液(mmol/L):NaCl 100，KCl 10，MgSO45.0，glucose 20，taurine 10，MOPS 10，用KOH将pH调至7.3。葛根素注射液，安徽同仁药业有限公司出品，批号H20045081。胶原酶Ⅱ，Taurine，MOPS，HEPES，Tris-GTP，EGTA，均购自Sigma公司。TTX，大连瑞芳生物物品有限公司。其余均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心室肌细胞动作电位记录 将大鼠击昏后，速取心脏置于37℃95%O2和5%CO2饱和台氏液中，分离出心室肌用0号不锈钢针固定于恒温(36±0.5)℃、恒流(5 ml/min)灌流槽底部。以直径0.5 mm不锈钢电极作细胞外刺激。用微操纵仪将电极插入心室肌细胞，待放大器上显出电位-70～-90mV即为静息电位，然后用刺激器经刺激隔离器输出波宽5 ms、频率1 Hz、强度为阈值的1.5倍的刺激。记录电极为充3mmol/L KCl的玻璃电极，电阻为10～15 MΩ，插入到细胞内引出动作电位，信号经微电极放大器放大后输入双线示波器中，同时经BL-420F生物机能实验系统输入计算机中，用MCP2000程序显示、处理分析。

1.2.2 大鼠心室肌细胞分离 将大鼠击昏后，速取心脏置于4℃MOPS液中(3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液，MOPS BUFFER)，去除周围结缔组织。将心脏连于Langendorff灌流装置上，经主动脉逆向灌流。先用无钙MOPS液灌流5 min，然后用含50μmol/L Ca2+和0.035%胶原酶Ⅱ、1% 牛血清白蛋白的MOPS液灌流5 min取下心脏，剪去心房，在含有100μmol/L Ca2+和1% 牛血清白蛋白的MOPS液中剪碎、吹打、温孵10min，尼龙网过滤，将细胞悬液的钙浓度提高到1μmol/L，室温保存。灌流液用100%的O2饱和，灌流系统的温度保持在37℃。

1.2.3 大鼠心室肌细胞通道电流的记录 用膜片钳全细胞记录法，在电压钳制下记录IK1。在室温25℃下吸取上述细胞悬液1滴入细胞浴槽中，置于倒置显微镜(Olympus lX70，japan)工作台上，待细胞贴壁后，用不同的灌流液持续灌流，流速2 mmol/L。选择横纹清晰、无收缩的细胞使用，微操纵器使阻抗为2～4MΩ、充满电极内液的玻璃微电极与细胞表面形成巨阻抗封接，然后击破细胞膜，补偿电容电流和电极串联电阻，形成全细胞记录。信号经Ag/AgCl电极引导，由膜片钳放大器(Axopatch 2008，USA)放大，经电脑运行pClamp 6.0.3)程序(Axon lnstru ments，USA)通过A/D、D/A转换(Digidata 1200serious interface，USA)控制刺激的发放和信号采集。电流经1 Hz滤波后储存于计算机硬盘中。

1.2.4 检测指标 测定动作电位的各项参数 静息电位(resting potential，RP)、动作电位幅度(action potential amplitude，APA)、最大去极化速率(maximum，Vmax)、动作电位复极至50%、90%(action potential duration，APD50、APD90)的时间 。离子通道电流以正常细胞外液记录的电流锋值为100%，加药后的电流为正常电流的百分数。

1.3 数据处理

2 结果

2.1 不同浓度的葛根素对大鼠心室肌细胞动作电位的影响

在台氏液中记录到动作电位后，稳定0.5 h，把0.005、0.01、0.015 mmol/L Pur分别加入到灌流液中，灌流 30min。结果显示:不同浓度Pur对大鼠 RP、APA、Vmax的影响没有统计学意义，但均能延长APD50、APD90，从而影响动作电位时程，且随着浓度的增大而增加(P＜0.05，P＜0.01，表1)。

Tab.1 Effects of the different concentration pur on action potential in rat myocardium(，n=6)

Tab.1 Effects of the different concentration pur on action potential in rat myocardium(，n=6)

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Group RP/mV APAmV VmaxV/s APD50/ms APD90/ms Control -89.8±3.4 110.7±8.7 228.3±13.1 14.7±2.3 68.6±8.7 Pur(mmol/L)0.005 -87.1±2.3 112.6±9.3 234.4±16.2 17.6±3.8* 76.3±11.4*0.01 -85.9±2.7 109.9±6.1 237.2±18.6 29.7±4.9** 93.0±13.7**0.015 -71.7±3.1 108.2±29.4 236.6±19.4 40.8±5.4** 127.2±18.4**

2.2 不同浓度的葛根素对大鼠心室肌内向整流钾电流的影响

台氏液中1μmol/L Nifedipine阻断Ica-L，加20μmol/L TTX阻断INa，常规电压钳下，保持电压-40mV，钳制电压-120mV、持续500ms、阶跃10mV、刺激频率0.2Hz的去极化脉冲引出。灌流液中分别加入0.005、0.01、0.015 mmol/L Pur，记录不同钳制电压下心肌细胞的IK1。结果显示，不同浓度的Pur均能抑制不同去极化水平的 IK1，0.005 mmol/L Pur对IK1抑制率为18.6±2.1%(P＜0.05)、0.015 mmol/L Pur对IK1抑制率达到56%±1.8%(P＜0.01)并呈量效关系(图 1见下页)。

3 讨论

Fig.1 Effects of the different concentration pur on IK1in rat myocardium

大鼠心肌细胞电生理特点与人相似[2，3]，本实验用常规微电极方法和膜片钳技术记录Pur对大鼠心室肌细胞AP、IK1的影响，以探讨Pur抗心律失常的作用机理。本研究给药前钳制电位为-120～-60mV时，IK1为内向电流，当膜电位去极一外向电流减小，因此认为记录到的电流为IK1[4]。动作电位3相快速复极化过程中，IK1为外向电流，其可促进晚期复极[5]。用药物抑制IK1这一外向电流，将抑制细胞复极化从而延长动作电位时程。IK1通道在静息电位-90mV下不易诱发心室肌细胞IK1的内向电流，因此本研究保持电位-40mV，-120mV钳制电压下记录葛根素对IK1的影响。实验结果显示:不同浓度的Pur能延长心室肌细胞APD50、APD90，可能是通过减少内向整流钾电流实现的，这也可能是Pur延长大鼠心室肌动作电位时程的机理之一。由于心肌细胞动作电位是由多种离子流构成，因此还需研究Pur对其它离子流的影响才能得到Pur抗心律失常完整的结论。

[1]王永霞，何立人.葛根素的心血管系统药理作用及机理研究[J].上海中医药杂志，2004，38(4):1-3.

[2]He J Y，KargacinM E，Kargacin G J，et al.Tamoxifeninhibits Na+and K+current at ventricular myocytes[J].AmJ Physiol Heart Circ Physiol，2003，285(2):661-668.

[3]Bryant S M，Shipsey S J，Hart G.Normal regional distribution of membrane current density in rat left ventricle is altered in cate-cholamine-induced hypertrophy[J].Cardiovasc Res，1999，42(2):391-401.

[4]黄爱杰，李立环，陈 雷，等.氯胺酮对离体大鼠心室肌细胞内向整流钾电流的影响[J].中华麻醉学杂志，2006，26(1):46-48.

[5]张 华，马兰香，杨星昌，等.葛根素对大鼠心肌细胞离子通道的影响[J].第四军医大学学报，2006，27(3):249-251.