翟庆峰，刘洪涛，李媛媛，马 强

(1.潍坊医学院，山东 潍坊 261042;2.军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津 300050;3.潍坊市妇幼保健院，山东 潍坊 261011)

1993年Marber等发现，心肌缺血预适应(ischemia preconditioning，IPC)的心脏保护作用在1～2 h即消失，但其后 24h又可重现，因此指出IPC存在早期预适应(early preconditioning，EPC)和延迟预适应(delayed preconditioning，DPC)。由于DPC具有较长的保护作用时相而更具有应用价值。Hangaishi等[1]发现鼠经缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)后，血红素氧合酶-1(HO-1)和HO-1 mRNA皆显著增加，证实作为一种内源性热休克蛋白(HSP)，HO-1对心肌I/R起保护作用。但HO-1在DPC中是否也作为效应蛋白起保护作用，尚未见报道。因此本实验拟从细胞水平对此问题进行研究。

1 材料与方法

1.1 心肌细胞培养

新生1～5 d的Wistar大鼠(军事医学科学院卫生与环境研究所动物中心提供)，剪取心脏，用含20%胎牛血清的MEM培养液制备成细胞悬液(细胞密度1.0～4.0×106cells/ml)接种于培养瓶中，置于 37℃、5%CO2的培养箱培养。培养5 d后选自律性搏动大于100beats/min的心肌细胞用于实验。

1.2 实验模型

参考Shiono等[2]的方法，取培养5 d的心肌细胞，用 PBS冲洗3次后向培养瓶中加入已用氮饱和的D-Hanks液，置于缺氧干燥瓶中，以5 L/min流量向干燥瓶内持续充入95%氮气+5%CO2，测氧浓度＜1%，即“缺血”，将D-Hanks液换成含20%胎牛血清的MEM培养液，置于95%的空气+5%CO2培养箱培养，即“再灌注”。按上述“缺血”、“再灌注”方法，行10min“缺血”，10min“再灌注，如此反复 4次，模拟细胞缺血预适应”。24h后缺血2 h，再灌注 1 h，即为“I/R”。

1.3 实验分组

(1)对照组(CN):正常培养30h。(2)缺血/再灌注组(I/R):正常培养27 h后行缺血2 h，再灌注1 h。(3)缺血预适应+缺血/再灌注组(IPC+I/R，以PC表示):正常培养1 h后行10min“ 缺血” ，10min“ 再灌注” ，如此反复 4次，24h 后行缺血2 h，再灌注1 h。(4)HO-1抑制剂+缺血预适应+缺血/再灌注组(ZnPP+IPC+I/R，以ZP表示):加入HO-1抑制剂 ZnPP(终浓度 10μmol/L)，1 h 后行 10min“缺血” ，10min“再灌注，如此反复4次，24h后行缺血2h，再灌注1 h。(5)HO-1诱导剂+缺血/再灌注组(hemin+I/R，以HE表示):加入HO-1诱导剂hemin(终浓度10μmol/L)，24h后行缺血 2 h，再灌注1 h。

1.4 指标测定及方法

1.4.1 RT-PCR法测定HO-1mRNA表达 参照分子克隆实验指南提取心肌细胞总RNA，然后进行逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)。结果用扩增条带与β-actin条带的灰度值表示。

1.4.2 MTT法测定细胞存活率 按细胞密度1×105cells/ml，100μl/well将细胞接种于96孔培养板中。各组实验实施如前所述，过24h后用MTT法测定细胞存活率。

1.4.3 心肌细胞培养液中MDA含量的测定 按细胞密度1×105cells/ml，130μl/well将细胞接种于 96 孔培养板中。 各组实验实施如前，培育5 h后参照改良硫代巴比妥酸法测定细胞培养液中脂质过氧化物含量，以MDA含量表示心肌细胞脂质过氧化程度。

1.4.4 荧光分光光度计测定心肌细胞胞内[Ca2+]i 细胞种于25 ml培养瓶中，细胞浓度3×106cells/ml，2.5 ml/瓶。 各组实验实施如前，参照Terry[3]的方法用荧光分光光度计测定心肌细胞胞内[Ca2+]i。

1.5 统计处理

2 结果

2.1 心肌细胞HO-1mRNA表达量的变化

除ZP组(0.48±0.05)外，各组心肌细胞中HO-1 mRNA表达量均明显高于CN组(0.53±0.03，P＜0.05)，PC组(1.76±0.14)和HE组(1.58±0.21)又显著高于IR组(0.89±0.09，P＜0.05)和ZP组(图1)。

Fig.1 Levels of HO-1 mR NA in myocardial cells subjected to the I/R injury

2.2 HO-1对心肌细胞存活率、细胞培养液中MDA含量及心肌细胞内[Ca2+]i的影响

各组再灌注后心肌细胞存活率、MDA含量和胞内Ca2+含量皆具有显著性差异。组间比较:与CN组比较，I/R组、PC组和ZP组再灌后细胞存活率显著降低，MDA含量和胞内[Ca2+]i显著升高;与I/R组比较，PC组和HE组细胞存活率显著升高，MDA含量和胞内[Ca2+]i皆显著降低;PC与ZP组间有显著性差异，与HE组比较未见显著性差异(表1)。

Tab.1 Effects ofHO-1 onthe cell survival rate，theMDA concentration in cell culture medium and the[Ca2+]i in cell(，n=8)

Tab.1 Effects ofHO-1 onthe cell survival rate，theMDA concentration in cell culture medium and the[Ca2+]i in cell(，n=8)

CN:Control group;I/R:I/R group;PC:IPC+I/R group;ZP:HO-1 inhibitor ZnPP+IPC+I/R group;HE:HO-1 inductor hemin+I/R group*P＜0.05 vs CN;#P＜0.05 vs I/R;△P＜0.05 vs PC

Group Cell survival rate(%) MDA(μmol/L) [Ca2+]i(nmol/L)CN 94.22±4.25 10.70±2.61 112.20±47.59 I/R 51.91±5.11* 51.42±15.83* 1633.34±377.89*PC 80.45±12.63*# 21.59±4.01*# 349.40±55.48*#ZP 63.73±12.15*△ 38.22±10.70*#△ 811.06±86.66*△HE 81.16±10.71*# 18.21±3.07*# 249.25±53.95#

3 讨论

内源性信号传导因子CO的发现促使人们对HO的心肌保护作用进行了深入的研究。而DPC是迄今为止最有效的保护心肌I/R损伤的内源性保护措施，为证实DPC是否能诱导HO-1的高表达，本实验对心肌细胞HO-1mRNA进行了测定，结果发现，I/R损伤后，HO-1mRNA表达显著增加，而如果于I/R损伤前24h行IPC，则HO-1mRNA进一步显著增加，表明IPC可能作为刺激因素较I/R损伤更能引起心肌HO-1 mRNA的表达上调，此结果与Hangaishi等[1]及易凌等[4]研究结果基本一致。另外，本实验还人为地加入了HO-1抑制剂和诱导剂，造成了HO-1不同的表达梯度。结果发现，如果在IPC前加入HO-1抑制剂ZnPP，则 HO-1mRNA显著降低，而加入诱导剂hemin后行I/R，则HO-1mRNA维持一个较高表达水平，由此推测，HO-1与IPC两者有着密切的关系。

为了证实HO-1在DPC中对I/R损伤是否起作用，本实验测定了心肌细胞存活率、胞内[Ca2+]i和细胞培养液中MDA含量。结果发现，I/R损伤可引起心肌细胞发生脂质过氧化损伤和钙超载，使得心肌细胞存活率显著下降，而IPC和HO-1诱导剂则可显著降低脂质过氧化损伤和胞内钙离子浓度，保护心肌细胞，但如果在 IPC前加入HO-1抑制剂，则IPC的延迟保护作用将被消除，表明IPC确实对心肌细胞的I/R损伤具有延迟保护作用，而HO-1在这一延迟保护作用中起着积极的作用。

实验表明，IPC可以诱导心肌细胞HO-1mR NA表达增多，对24h后发生的心肌I/R损伤产生保护作用。但HO-1是如何参与IPC对心肌I/R损伤的延迟保护作用，以及IPC是如何激发HO-1的，这些问题将在以后的实验中进行深入的探讨。

[1]Hangaishi M，Ishizaka N，Aizawa T，et al.Induction of heme oxygenase-1 can act protectively against cardiac ischemia/reperfusion in vivo[J].Biochem Biophys Res Commun，2000，279(2):582-588.

[2]Shiono N，Rao V，Weisel R D，et al.L-arginine protectshuman heart cells from low-volume anoxia and reoxygenation[J].AmJ Physiol Heart Physiol，2002，282(3):H805-815.

[3]Terry C M，Clikeman JA，Hoidal J R，et al.TNF-αand IL-1αinduce heme oxygenase-1 via protein kinase C，Ca2+，and phospholipase A2 in endothelial cells[J].Am J Physiol，1999，276(5):H1493-1501.

[4]易 凌，王天辉，刘洪涛.血红素氧合酶-1 mRNA在离体大鼠心肌缺血预处理中的变化[J].中国应用生理学杂志，2004，20(3):252-253.