廖英俊，金亚平，林 琳，汤 浩

(1.中国医科大学基础医学院生理学教研室，辽宁 沈阳 110001;2.中国医科大学公共卫生学院劳动卫生与职业病学教研室，辽宁 沈阳 110001)

近来的研究发现，氧化损伤也是抗癌药顺铂(cisplatin)对正常组织的损伤机制之一[1，2]。8-羟基-2-脱氧鸟嘌呤核苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG)是公认的DNA氧化损伤的生物标志物[3，4]。本研究中采用免疫组化技术对注射顺铂后小鼠的肾和脑组织中8-OHdG进行了分析，以检测顺铂对正常组织细胞内DNA的氧化损伤情况。

1 材料与方法

1.1 动物和分组

ICR系小鼠12只，体重(30±2)g，由中国医科大学实验动物中心提供。实验期间小鼠自由进食和饮水。观察一周后，其中6只小鼠作为实验组，每天腹腔注射3.5 mg/kg bw顺铂，连续注射5 d;另6只小鼠作为对照组，每天注射等量的生理盐水。停药后第3天，经心脏用10%福尔马林灌流固定10min，迅速取脑和肾组织。常规石蜡包埋切片。

1.2 免疫组织化学染色

1.2.1 方法 灌流固定后的脑和肾组织经常规乙醇脱水、二甲苯和液体石蜡处理后包埋。4μm连续切片，封固于多聚赖氨酸玻片。切片按常规脱蜡和逐级乙醇水化后，蒸馏水中浸泡10min。采用SABC法:H2O2封闭30min，0.1 mol/L PBS洗3次，各5 min，复合消化液7 min(使DNA变性)，PBS洗3次，各5min。正常兔血清室温孵育30min，PBS洗3次，各5min，滴加鼠抗羊8-OHdG单克隆抗体(5μg/ml，购自日本防老化研究所)，室温1 h，PBS洗3次，各5 min，加生物素化兔抗鼠IgG抗体，室温孵育30min，PBS洗3次，各5min，加碱性磷酸酶底物试剂盒(Histofine SAB-AP，Nichirei，Japan)10min，PBS 洗4次，各5 min，显色5 min，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。另用PBS代替一抗作阴性对照。

1.2.2 结果的图像分析 每张切片随机选取5个高倍视野，用显微图像分析仪进行定量分析，测定免疫阳性物质积分光密度(integral optical density，IOD)值。IOD值越大表示视野内8-OHdG阳性反应物的总色度越强，即视野内8-OHdG的总量越多。

1.3 统计分析

2 结果

2.1 8-OHdG在对照组与顺铂给药组小鼠大脑皮质中的表达

对照组在大脑皮质中无免疫反应阳性表达。8-OHdG染色的阳性细胞位于细胞核内，呈现红色，胞质上未见明显染色，给药组在该区的毛细血管内皮细胞核上可见大量免疫反应阳性表达物质(图1见彩图页Ⅱ)。

2.2 8-OHdG在对照组与顺铂给药组小鼠海马区的表达

对照组在海马区中无免疫反应阳性表达。给药组在海马区的毛细血管内皮细胞核上可见许多红色8-OHdG免疫反应阳性表达物质(图2见彩图页Ⅱ)。

2.3 8-OHdG在对照组与顺铂给药组小鼠的肾脏中的表达

对照组在肾皮质中无免疫反应阳性表达。给药组仅在肾小球的毛细血管内皮细胞核上可见许多红色免疫反应阳性表达物质(图3见彩图页Ⅱ)。

2.4 脑和肾组织中8-OHdG免疫组化图像分析

顺铂给药组小鼠的脑和肾组织中的8-OHdG表达与对照组比较均显著增强，差异有统计学意义(表1)。

Tab.1 Comparison of the IOD value of 8-OHdG between the brain and kidney of mice(，n=6)

Tab.1 Comparison of the IOD value of 8-OHdG between the brain and kidney of mice(，n=6)

IOD:Integral optical density**P＜0.01 vs control group

Group Cerebral cortex Hippocampus Renal cortex Experimental44.22±12.90**37.50±10.70**33.87±7.63**Control 3.94±1.33 2.93±0.62 6.44±1.62

3 讨论

本研究结果显示，顺铂可引起大脑皮质和海马的毛细血管内皮细胞及肾小球毛细血管内皮细胞的DNA氧化损伤。这为研究顺铂的脑组织和肾组织毒作用机制提供了实验依据。由于顺铂是通过血液进入机体的各组织，因此，各组织内的毛细血管内皮细胞应是顺铂直接作用与损伤的主要细胞，本研究结果证实了这一点。肾脏是顺铂毒作用的主要器官。本研究结果显示，以3.5 mg/kg bw的剂量连续5天注射顺铂，只在肾小球的毛细血管内皮细胞中产生了DNA的氧化损伤，而在肾小管上皮细胞中未见明显的氧化损伤。这与我们前期的研究结果一致[5]。在前期研究中，给予3.5 mg/kg bw顺铂的小鼠肾组织的抗氧化系统出现了氧化应激的代偿反应，肾GSH水平和GSH-Px活性明显升高，而作为脂质氧化损伤检测指标的肾MDA水平没有明显的升高。这可能是肾组织内抗氧化系统的应激性代偿有效地清除了顺铂诱导产生的自由基，有效地保护了肾小管上皮细胞内的生物大分子免于氧化损伤。本研究中，对肾组织8-OHdG的检测结果符合这一推论。

[1]Rabik C A，Dolan M E.Molecular mechanisms of resistance and toxicity associated with platinating agents[J].Cancer Treat Re v，2007，33(1):9-23.

[2]Rybak L P，Whitworth C A ，Mukherjea D，et al.Mechanismsof cisplatin-inducedototoxicity and prevention[J].Hear Res，2007，226(1-2):157-167.

[3]Hwang E S，Kim G H.Biomarkers for oxidative stress status of DNA，lipids，and proteins in vitro and in vivo cancer research[J].Toxicol，2007，229(1-2):1-10.

[4]Pilger A，Rǜdiger H W.8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine as a marker of oxidative DNA damage related to occupational and environmental exposures[J].Int Arch Occup Environ Health，2006，80(1):1-15.

[5]Liao Y J，Tang H ，Jin Y P.Study of toxic effects on hearing，kidney and liver of mice induced by anticancer agent of cisplatin and their mechanisms[J].Chin Pharmacol Bull，2004，20(1):82-85.