段文卓，王一鹏，宫海民

(潍坊医学院基础部，山东 潍坊 261042)

既往研究大多把硫化氢(H2S)作为一种毒性气体研究其对机体神经系统及呼吸系统的毒性作用。近年来发现含硫氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸等)在胱硫醚β合成酶(CBS)、胱硫醚γ裂解酶(CSE)催化下产生的H2S是与一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)相似的气体信号分子，具有多种生理功能[1]。目前对H2S的研究主要集中于其作为神经调节因子及对心血管系统的作用，还没有研究涉及到H2S对凝血相关系统的调控。

血小板的L-Arg/NO系统可将L-Arg转运入血小板后在一氧化氮合酶(NOS)的作用下生成NO。血小板源性NO具有降低血小板活性、聚集性的作用，可以减少动静脉血栓、及某些心血管疾病的发生危险。对血小板L-Arg转运系统的研究有助于解释血栓疾病及心血管急性事件的相关机制及致病机理。

1 材料与方法

1.1 材料

健康SD大鼠 30只，雄性，体重(220±15)g，由潍坊医学院实验动物中心提供。L-[2，3，4-3H]Arginine、L-Arginine为 SIGMA公司产品;其余试剂为市售分析纯试剂。

1.2 实验和分组

自大鼠腹主动脉取血15 ml，加入3.8%枸橼酸钠抗凝(血与抗凝剂体积比9∶1)。离心(200g，15 min)制备富血小板血浆(PRP)，存于4℃，待用时将PRP置37℃孵育90min。将制备好的PRP分为3组(n=10)，分别为A组:对PRP进行不同浓度条件下血小板L-Arg转运测定;B组:对PRP进行不同孵育时间条件下血小板L-Arg转运测定;C组:对PRP进行L-Arg酶转运动力学测定。

1.3 血小板孵育

A组PRP用H2S终浓度分别为0、6.25、12.5、25、50、100μmol/L的Hepes液 37℃孵育 15 min;B 组PRP用H2S终浓度 50μmol/L 的Hepes液37℃分别孵育 1、5、15、30、60min;C 组 PRP 用H2S 终浓度50μmol/L的Hepes液37℃孵育15 min。A、B、C组PRP洗涤1次后将血小板用Hepes液调整血小板(pt)数为2×108pt/ml，进行L-Arg转运测定。

1.4 L-Arg转运测定

A、B组 PRP分别加入终浓度 50μmol/L3H-LArg37℃孵育5 min;C组PRP分别加入不同浓度3HL-Arg(7.8125 、15.625 、2.5 、31.25 、62.5 、125 、250、500和1000μmol/L)37℃孵育 5 min。A、B 、C 组PRP 分别微孔抽滤装置过0.45μm孔径微孔滤膜抽滤，用HEPES液4 ml冲洗3次，晾干滤膜，置于闪烁瓶中，加入闪烁液，同时设立不加样本的非特异平行对照管，以液闪仪测定放射活性。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 H2S孵育浓度对血小板L-Arg转运的影响

H2S表现出对血小板L-Arg转运的明显抑制作用。H2S浓度为0时L-Arg转运速率为(11.25±0.8776)pmol/(2.0×108plts◦min)。H2S浓度12.5μmol/L(H2S 血清生理浓度 50μmol/L)时抑制作用即具统计学意义(7.868±0.8885 pmol/(2.0×108plts◦min)，P＜0.05)，这一效应与H2S生理浓度的抑制效应相似(P＞0.05，图1)。由于更高浓度H2S对细胞将表现出毒性作用，因此可以认为H2S的抑制效应并不随浓度的增加而改变。

Fig.1 Effect of H2S incubation concentration on platelet L-Arg transport(¯x ± s)

2.2 H2S孵育时间对血小板L-Arg转运的影响

生理浓度H2S对血小板L-Arg转运的影响与孵育时间关系不大，从1 min到60min各组表现的抑制作用相似(P＞0.05，图2)。

Fig.2 Effect of 50μmol/L H2S incubation time on platelet L-Arg transport()

2.3 H2S对血小板L-Arg转运的影响

相对于 control组 ，生理浓度(50μmol/L)H2S 可以显著降低血小板L-Arg转运的Vmax(H2S 33.40±2.548 pmol/(2.0×108plts◦min);control(61.20±4.454)pmol/(2.0×108plts◦min)，P ＜0.05)，但对米氏常数(Km)无明显影响(H2S 303.8±56.29μmol/L;control(325.4±56.31)μmol/L，P ＞0.05，图3)，提示H2S对L-Arg转运存在非竞争性抑制。

Fig.3 Effect of 50μmol/L H2S on platelet L-Arg transport curve(¯x ± s)

3 讨论

血小板的L-Arg/NO系统的主要作用是将血浆L-Arg转运入血小板，在一氧化氮合酶(NOS)的作用下生成NO。血小板源性NO，通过激活血小板鸟苷酸环化酶，使血小板内cGMP含量升高，从而抑制了血小板的粘附与聚集功能[2]。冠心病、中风、动静脉血栓等疾病的发病在很大程度上与体内血小板状态有关。当血小板源性NO不能及时生成时，缺乏自身调节能力的血小板将很容易出现功能障碍。已知多种心血管疾病危险因素可抑制血小板L-Arg转运及NOS活性，造成血小板源性NO生成不足，并继而引起心脑血管疾病的发病。

H2S主要来源于含硫氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸等)在CBS、CSE催化下产生，在体内主要有两种存在形式:气体分子H2S形式占1/3;硫氢化钠(NaHS)形式占2/3。现有研究表明生理浓度的H2S对神经系统、心血管系统等具有生理调节功能，其功能包括调节学习与记忆[3]、降低组织与细胞有氧氧化水平[4]、激活血管平滑肌KATP通道造成血管舒张[5]等。另有研究表明H2S与NO的关系密切，在心血管系统H2S与NO之间互相存在负反馈调节作用[6]，但在凝血/抗凝系统二者关系尚不清楚。

大鼠血清的H2S生理浓度为(45.6±14.2)μmol/L，本次研究使用与生理浓度相近的H2S气体溶液对血小板L-Arg转运系统的影响评价H2S对血小板的生理调节作用。实验结果表明H2S可以快速的抑制血小板L-Arg转运系统，这一抑制作用在较低浓度下即可实现，而转运动力学结果提示H2S对L-Arg在血小板的转运具有非特异性竞争作用。这种效应可以迅速的造成血小板内 L-Arg的储备降低，生理情况下这一改变或许对机体凝血抗凝平衡的改变并不明显，但在某些病理状况下造成血小板源性NO生成不足从而加重疾病表现甚至引发新的病变。

[1]Kimura H.Hydrogen sulfide as a neuromodulator[J].Mol Neurobiol，2002，26(1):13-19.

[2]王荣花，张宝娓，唐朝枢.红细胞与血小板的L-精氨酸/NO系统在心血管疾病中的变化[J].心血管病学进展，2003，24(4):243-247.

[3]Kimura H.Hydrogen sulfide induces cyclic AMP and modulates the NMDA receptor.[J].Biochem Biophys Res Commun，2000，267(1):129-133.

[4]Geng B，Yang J H，Qi F，et al.H2S generated by heart in rat and its effects on cardiac function[J].Biochem Biophys Res Commtm ，2004，313(2):362-368.

[5]Zhao W，Zhang J，Lu Y，et al.The vasorelaxant effect of H2S as a novel endogenous gaseous KATPchannel opener[J].EMBO，2001，20(21):6008-6016.

[6]Zhang Q Y，Du J B，Zhang Q Y，et al.Impact of endogenous nitric oxide on the hydrogen sulfide/cystathionine-γlyase system in pulmonary hypoxic rats[J].Appl Clin Pediatr，2003，18(3):865-867.