吴 畏，孟德胜，傅若秋，温 悦，赵艳艳，李卓恒，娄 海，卢来春（第三军医大学大坪医院药剂科，重庆市 400042）

贯叶连翘（Hypericum perforatum）为藤黄科金丝桃属植物[1]，是2005年版《中国药典》新增国际研究热点品种[2]。其主要活性成分金丝桃素具有光敏活性和光动力作用，有较好的抗病毒、抗肿瘤功效，同时也是贯叶连翘抗抑郁的主要活性成分之一[3，4]。在我国，贯叶连翘广泛分布于河南、河北、山东、甘肃、四川、云南等地，由于气候、水质等差异，各地品种质量均有差异。因此，笔者采用高效液相色谱（HPLC）法测定不同产地贯叶连翘不同部位中金丝桃素的含量，以期为评价贯叶连翘的质量提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

LC-10Atvp型HPLC仪、SPD-10A型紫外-可见光检测器（日本Shimadzu公司）；十万分之一电子天平（德国Sartorius公司）；RE-201c型恒温水油浴锅、旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限公司）；KQ-500E型医用超声波清洗器（昆山市超声仪器厂）。

1.2 试药

金丝桃素标准品（成都普瑞法科技开发公司，纯度：99.1%，批号：081204）；甲醇（色谱纯，韩国SK Chemicals）；水为纯化水，无水乙醇、氨水均为分析纯；贯叶连翘药材购自重庆慧远药业有限公司，分别产自云南、四川、甘肃，均为2008年产，经重庆市药品检验所鉴定均为真品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Boston pHlex ODS C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（85 ∶15，氨水调pH 9.5）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：588 nm；进样量：20 μL。在此色谱条件下，金丝桃素与提取物中其它成分有较好的分离度。色谱见图1。

2.2 标准品贮备液的制备

精密称取金丝桃素标准品9.01 mg，溶于20 mL二甲基亚砜中，再转入250 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，精密吸取1.00 mL，置于10.0 mL棕色容量瓶中，以甲醇定容，制备成浓度为3.60 μg·mL-1的标准品贮备液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取不同产地贯叶连翘的不同部位各5.0 g，剪碎，置于烧瓶中，加入100 mL无水乙醇，超声波提取10 min；再放入80℃水浴锅中，避光回流2 h，抽滤，滤液避光保存；滤渣加50 mL无水乙醇重复回流提取2次，合并滤液，80℃下旋转蒸发浓缩，浓缩液溶解于10.0 mL二甲基亚砜中，转移至50.0 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，得样品提取液。吸取适量（各产地药材花、叶部位提取液0.10 mL，甘肃产药材茎部位提取液1.00 mL，四川和云南产药材茎部位提取液10.00 mL），置于10.00 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，10000 r·min-1离心10 min，取上清液，即得不同产地贯叶连翘不同部位供试品溶液。

2.4 阴性对照溶液的制备

取适量无水乙醇置于烧瓶中，按照“2.3”项下方法自“超声波提取10 min”起操作，制成阴性对照溶液。

2.5 线性关系考察

精密吸取上述标准品贮备液0.20、0.50、1.00、2.00、5.00 mL，分别置于5.00 mL棕色容量瓶中，以甲醇定容，得不同浓度的标准品溶液。按“2.1”项下色谱条件进样，每个浓度3次，每次进样20 μL，测定峰面积积分值。以检测浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，制备标准曲线，得回归方程为Y＝59503X+1266（r＝0.9997）。结果表明，金丝桃素检测浓度在0.14～3.60 μg·mL-1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验

精密量取标准品贮备液1.00 mL，置于5.0 mL棕色容量瓶中，以甲醇定容，按“2.1”项下色谱条件进样20 μL，连续进样6次，测定峰面积。结果，RSD＝1.82%，表明仪器精密度良好。

2.7 重现性试验

取同一产地同一部位（甘肃产药材花、叶部位）药材，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果，RSD＝1.83%，表明方法重现性良好。

2.8 稳定性试验

取同一供试品溶液，在0、1、2、3、4 h时间点分别进样分析。结果，金丝桃素峰面积基本不变，RSD＝1.97%，表明供试品溶液在4 h内基本稳定。

2.9 加样回收率试验

吸取已知含量的同一产地同一部位（甘肃药材花、叶部位）药材提取液6份，每份含金丝桃素约2.8 mg，分别精密加入相应含量的金丝桃素标准品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.10 样品含量测定

取3个产地的贯叶连翘药材，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算样品含量，结果见表2。

表2 不同产地贯叶连翘不同部位中金丝桃素含量测定结果（n＝3）Tab 2 Content determination of hypericin in different parts of H.perforatum from different habitats（n＝3）

3 讨论

由表2可知，不同产地贯叶连翘的不同部位中，金丝桃素的含量差异很大：甘肃产贯叶连翘花、叶与茎部位金丝桃素含量最高，四川产含量次之，云南产最低；而同一产地贯叶连翘中，茎部位金丝桃素含量均低于花、叶部位。故在临床或科研应用中，建议采用贯叶连翘植物花、叶及茎上半部分入药。

由于不同产地不同部位贯叶连翘中金丝桃素含量差别较大，重现性的RSD也均不同。其中，茎部位金丝桃素含量测定的RSD均＞7%，最大可达到12%。由此推测：除了茎部位金丝桃素含量低造成的误差，很有可能是由于茎的上部与下部的含量差异大，造成每次取材质量无法均一。

金丝桃素为萘骈二蒽酮类结构，微溶于甲醇，其甲醇溶液作吸收波长扫描，在588 nm波长处有较强吸收，故选择可见光区的588 nm作为检测波长。

金丝桃素在酸性溶液中溶解度极低。笔者对比了酸性和碱性流动相，发现采用酸性流动相时金丝桃素主峰保留时间在40 min以后，洗脱效果较差；而采用氨水调流动相pH值至弱碱性可增加金丝桃素在流动相的溶解性，优化分离效果，主峰保留时间在9.5 min左右，故流动相采用甲醇-水（85∶15，氨水调pH 9.5）。

综上，本方法简便、准确、重现性好，可用于贯叶连翘的质量控制。

[1]高 颖.贯叶连翘提取物的药理活性研究进展[J].吉林医学，2008，29（21）：1954.

[2]费 曜，刘 新，王文苹.2005年版《中国药典》（公示稿）中药材部分修订动向[J].中国药房，2005，16（4）：314.

[3]白 洁，杨得坡.金丝桃素光动力学疗法与其诱导细胞凋亡、抗凋亡信号转导系统[J].中草药，2004，35（1）：106.

[4]C Quiney，C Billard，P Mirshahi，et al.Hyperforin inhibits MMP-9 secretion by B-CLL cells and microtubule formation by endothelial cells[J].Leukemia，2006，20（1）：583.