殷丹，陈科力

（湖北中医学院省部共建中药资源和中药复方教育部重点实验室，武汉市 430065）

江南卷柏又名地柏枝，为卷柏科植物江南卷柏Selaginella moelledorfii Hieron的全草，具有凉血止血、清热利湿的功效，民间用来治疗肝炎、各种内外出血等疾病。《广西中药材标准》将其作为石上柏的原植物之一收载，用于癌症及多种炎症的治疗[1]。江南卷柏含有黄酮类、木脂素类、有机酸类、酚类、糖类等化学成分，其中以黄酮类成分的研究较为深入。笔者研究发现，江南卷柏抑制黄嘌呤氧化酶、脂氧化酶[2]和抗肿瘤的有效部位主要是总黄酮部位。因此，本研究以总黄酮和浸膏得率为考察指标，对江南卷柏总黄酮的最佳提取工艺进行研究，并以紫外-分光光度法进行总黄酮的含量测定。

1 材料

1.1 仪器

U-2001型紫外-分光光度计（日本Hitachi公司）；BP-211D型十万分之一分析天平（德国Sartorius公司）。

1.2 试药

江南卷柏的全草采集于湖北宜昌雾渡河，经湖北中医学院陈科力教授鉴定为真品；穗花杉双黄酮标准品（省部共建中药资源和中药复方教育部重点实验室自制，HPLC测定质量分数＞99.0%）；所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 总黄酮的含量测定

2.1.1 标准品溶液的制备：精密称取减压干燥至恒重的穗花杉双黄酮标准品适量，加甲醇超声溶解并定容至25 mL容量瓶中，制成0.0172 mg·mL-1标准品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备：取江南卷柏药材10 g，以溶剂提取，将提取液过滤合并后定容至1000 mL容量瓶中，精密移取1 mL，以甲醇定容至25 mL容量瓶中，备用。

2.1.3 检测波长的确定：以甲醇作为试剂空白，照紫外-可见分光光度法，在200～500 nm波长范围内对标准品溶液和供试品溶液进行扫描，结果表明两者紫外吸收图谱类似，且在270 nm波长处均有最大吸收，故确定270 nm为检测波长。

2.1.4 标准曲线的制备：分别精密移取穗花杉双黄酮标准品溶液0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度。照紫外-可见分光光度法，以相应试剂为空白于270 nm波长处测定吸光度（A）。以吸光度（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标，制备标准曲线，得回归方程为A＝86.744C－0.0015（r＝0.9994）。结果表明，标准品在0.00172～0.00602 mg·mL-1浓度范围内与吸光度呈良好线性关系。

2.1.5 精密度试验：取供试品溶液适量，按“2.1.4”项下方法重复进行5次。结果，RSD＝0.6%，表明本方法精密度良好。

2.1.6 稳定性试验：取供试品溶液适量，按“2.1.4”项下方法，分别在0、2、4、6、8 h测定吸光度。结果，RSD＝1.7%，表明供试品在8 h内测定基本稳定。

2.1.7 重复性试验：取同一批药材，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.4”项下方法测定吸光度，重复5次。结果，RSD＝2.3%，表明方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验：精密移取已知含量的供试品溶液6份各0.5 mL，分别精密加入穗花杉双黄酮标准品溶液，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.4”项下方法测定，结果见表1。

2.1.9 供试品的含量测定：取供试品溶液适量，按“2.1.4”项下方法于270 nm波长处测定吸光度，按回归方程计算溶液中总黄酮的质量浓度。

表1 加样回收率试验结果Tab 1 The results of recovery test

2.1.10 浸膏得率的测定：精密移取江南卷柏提取液200 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后置烘箱内105℃干燥3 h，取出，置干燥器内，冷却30 min，迅速精密称定质量后计算浸膏得率。

2.2 不同提取方法的提取效果比较

2.2.1 冷浸法：取江南卷柏药材10 g，加15倍量75%乙醇室温浸渍48 h，提取液过滤后定容至1000 mL容量瓶中。

2.2.2 渗漉法：取江南卷柏药材10 g，先以少量75%乙醇浸泡1 h，使其充分溶胀后装入渗漉筒中，并以醇液浸泡过夜，再加15倍量75%乙醇进行渗漉，流速为1 mL·min-1，收集渗漉液并定容至1000 mL容量瓶中。

2.2.3 乙醇回流法：取江南卷柏药材10 g，加15倍量75%乙醇回流提取2次，每次2 h，提取液过滤后合并，定容至1000 mL容量瓶中。

2.2.4 结果比较：上述溶液分别取1 mL定容至25 mL容量瓶中，于270 nm波长处测定吸光度，按回归方程计算样品溶液中总黄酮提取量，并测定浸膏得率。结果表明，乙醇回流法提取效果最佳。不同提取方法的结果比较见表2。

表2 不同提取方法的结果比较Tab 2 Comparison of result of different extraction methods

2.3 正交试验及其结果

采用正交试验法，以乙醇浓度（A）、提取时间（B）、提取次数（C）、乙醇用量（D）为4因素，各取3个水平，按照L9（34）正交表进行乙醇回流提取试验，分别测定总黄酮的提取量和浸膏得率，作为考察指标，并对此进行统计学处理。结果表明，乙醇浓度对总黄酮提取量及浸膏得率影响较大，其次是提取时间，而提取次数和乙醇用量均无显著性差异。结合节约成本方面综合考虑，确定最佳组合是A2B1C1D1。因素水平见表3；正交试验结果见表4；方差分析结果见表5、表6。

表3 因素水平Tab 3 Factors and levels

表4 正交试验结果Tab4 Results of orthogonal experiment

表5 总黄酮提取量的方差分析结果Tab 5 Results of variance analysis of content of total flavonoids

表6 浸膏得率的方差分析结果Tab 6 Results of variance analysis of extracting rate

2.4 验证试验

根据筛选得到的最佳工艺A2B1C1D1提取3次，进行验证试验，得总黄酮的提取量为0.1552 g，浸膏得率为8.91%（n＝3）。

3 讨论

笔者前期研究发现，江南卷柏中的黄酮类成分大部分为双黄酮结构，其主要含穗花杉双黄酮，含量约占80%以上。本研究发现，采用传统的以芦丁为对照品、NaNO2-Al（NO3）3-NaOH为显色系统测定总黄酮含量的方法并不适合测定江南卷柏中的总黄酮类成分，因其紫外吸收曲线与芦丁的相差很大，测定的回收率较低，不足90%。故笔者直接以其主要黄酮成分穗花杉双黄酮作为标准品，以确保总黄酮含量测定方法的准确性。

本研究优选出江南卷柏总黄酮的最佳提取工艺条件为：用药材9倍量85%乙醇，回流提取2次，每次1 h。同时，还建立了以紫外-分光光度法测定江南卷柏总黄酮含量的方法，可为控制药材的质量提供可靠的科学依据。

[1]广西自治区卫生厅.广西中药材标准[M].南宁：广西科学技术出版社，1992：169.

[2]黎 莉，陈科力，方继德，等.卷柏属7种药用植物的提取物抑制黄嘌呤氧化酶的活性研究[J].中药材，2007，30（4）：445.