赵 艳，朴莉花，吴 坤

(1.哈尔滨医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，黑龙江哈尔滨 150081;2.哈尔滨市阿城区疾病预防控制中心，黑龙江哈尔滨 150300)

血脂异常与动脉粥样硬化的发生发展密切相关，是脑卒中、冠心病、心肌梗死和心脏猝死独立而重要的危险因素，也是导致高血压和糖尿病的重要危险因素［1］。贝特类降脂药物作为过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα)的配体，能够有效地降低甘油三酯水平和升高高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)水平，因而在临床上广泛应用［2－3］。

大规模临床试验结果显示，贝特类药物通常无不良反应，但部分患者会出现肝脏和肌肉损伤，表现为血中肌酸激酶(creatine kinase，CK)活性增加、肌无力和肌痛，严重者可出现肌病和横纹肌溶解症等药物不良反应［2，4－5］。本研究旨在观察苯扎贝特(bezafibrate)对人横纹肌RD细胞的毒性作用，探讨PPARα配体类降脂药物影响人骨骼肌细胞的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂与仪器

苯扎贝特购自ICN公司。改进的Eagle培养基(modified Eagle medium，MEM)购自Sigma公司;胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和胰酶购自Gibco公司。WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自Dojindo公司;MK886购自BioMol公司;总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购自 Qiagen公司;实时PCR引物与试剂盒购自Applied Biosystems公司。CO2培养箱(日本 Sanyo公司);超纯水仪(法国Millipore公司);相差倒置显微镜(日本Olympus公司);酶标仪(美国Molecular Devices公司);PCR仪(美国BioRad公司);ABI 7700实时荧光定量PCR仪(英国Applied Biosystems公司)。

1.2 细胞培养

RD细胞购自美国细胞资源库(American Type Culture Collection)。细胞在含有10%FBS、青霉素100 kU·L－1、链霉素 100 mg·L－1的 MEM 培养基中，于37℃含5%CO2的饱和湿度条件下培养，并用0.02%EDTA与0.25%胰酶混合液消化、传代培养。苯扎贝特溶于二甲亚砜(DMSO)，使用前用MEM培养液稀释为 10，30，100，300 和 1000 μmol·L－1;MK886 亦溶于 DMSO，终浓度为 1 μmol·L－1。

1.3 WST-1法测定细胞存活

处于对数生长期的RD细胞经常规消化，接种于96孔培养板中，每孔5.0×103个细胞，加入苯扎贝特0，10，30，100，300 和1000 μmol·L－1，每个剂量组设3个平行孔和空白孔。实验结束前每孔加入新鲜配制的20 μl WST-1，采用450 nm/690 nm双波长法用酶标仪测定吸光度(A)值，实验重复3次，并计算细胞存活率。细胞存活率(%)=(A实验组－A空白对照组)/(A对照组－A空白对照组)×100%。

1.4 RNA的提取及cDNA的合成

处于对数生长期的RD细胞经胰酶/EDTA消化，接种于6孔培养板，待细胞达80%融合后按分组加入药物进行处理，分别为单独苯扎贝特0，10，30，100，300 和 1000 μmol·L－1作用 24 h;或者相应浓度的苯扎贝特 +MK886 1 μmol·L－1作用 24 h组;加入 500 μl RLT缓冲液，涡旋混匀。根据RNeasy Mini Kit说明书进行操作，提取总RNA，用核酸蛋白分析仪测定RNA浓度和纯度。逆转录反应按Omniscript RT试剂盒说明书进行。

1.5 实时荧光定量 PCR方法检测 PPARα和PDK4 mRNA表达水平

采用TaqMan荧光标记的PPARα和丙酮酸脱氢酶激酶4(pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4)探针检测基因表达情况，以GAPDH基因作为内对照。按TaqMan Universal PCR Master Mix说明书配制体系，ABI 7700 PCR仪上95℃变性10 min，反应条件为:95℃ 15 s，60℃ 1 min，然后进行40个PCR循环，实验重复3次，结果用循环阈值(cycle threshold，Ct)方法进行分析，以公式2－ΔΔCt计算目的基因的相对表达水平。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 苯扎贝特对RD细胞存活的影响

与苯扎贝特0 μmol·L－1组相比，苯扎贝特30 和100 μmol·L－1对 RD 细胞存活无影响，苯扎贝特 300和 1000 μmol·L－1明显抑制 RD 的生长，有明显的细胞毒性，细胞生长分别被抑制13%和31%(P ＜0.01)。苯扎贝特 1000 μmol·L－1对细胞生长的抑制作用明显强于 300 μmol·L－1浓度的作用(P ＜0.01)(表1)。

表1 苯扎贝特对人横纹肌RD细胞生长的影响Tab.1 Effects of bezafibrate on human rhabdomyosarcoma RD cell proliferation

2.2 苯扎贝特对PPARα mRNA和PDK4 mRNA表达的影响

实时荧光定量PCR结果显示，苯扎贝特增加PPARα和PDK4基因的表达水平，呈浓度依赖关系(图1A 和图1B)。苯扎贝特 300 和 1000 μmol·L－1组PPARα mRNA的表达分别为苯扎贝特0 μmol·L－1组的 2 和 3 倍(P ＜0.05 和 P ＜0.01)。MK886 1 μmol·L－1与苯扎贝特同时作用于 RD 细胞明显抑制苯扎贝特上调PPARα表达的作用，分别降低47%和43%(P＜0.05)(图1A)。苯扎贝特10，30，100，300 和 1000 μmol·L－1组显著增加 PDK4 mRNA 的表达，分别为苯扎贝特0 μmol·L－1组的 6，24，55，104和 164倍(P＜0.01)。苯扎贝特 +MK886各组PDK4 mRNA表达显著高于MK886+苯扎贝特0 μmol·L－1组(P ＜0.01)，但明显低于单用苯扎贝特同一浓度组，苯扎贝特30，100，300和1000 μmol·L－1与 MK886 合用组分别降低了 44%，60%，69%和63%(P ＜0.05)。

3 讨论

本研究结果显示，RD细胞经苯扎贝特处理后，细胞生长明显受到抑制，表明苯扎贝特对RD细胞具有一定的毒性。

图1 实时荧光定量PCR检测苯扎贝特对RD细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)和丙酮酸脱氢酶激酶4(PDK4)mRNA表达的影响.药物作用RD细胞24 h.±s，n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，与 0 μmol·L－1组比较;#P ＜0.05，与相应的苯扎贝特组比较.Fig.1 Effect of bezafibrate on peroxisome proliferatorsactivated receptor α(PPARα)and pyruvate dehydrogenase kinase 4(PDK4)mRNA expression by real-time quantitative PCR in RD cells.

PPAR属于核受体超家族的一员，对脂类代谢发挥重要的调节作用，其中PPARα在脂肪酸氧化能力强的组织(如骨骼肌)中高表达，主要促进脂肪酸发生β-氧化，加速体内脂类的清除［6－8］。本研究结果发现，苯扎贝特在 10 ～ 100 μmol·L－1对 PPARα mRNA 表达没有影响，300 和 1000 μmol·L－1时明显增加PPARα mRNA的表达，PPARα拮抗剂MK886明显抑制苯扎贝特对PPARα的激活作用，说明苯扎贝特引起肌细胞毒性的过程中PPARα可能发挥了作用。

碳水化合物在丙酮酸脱氢酶复合物催化下，通过丙酮酸脱羧形成乙酰辅酶A进入线粒体用于氧化，并在肌肉代谢中发挥重要作用，PDK4可抑制该复合物的活性［9－10］。本研究结果显示，苯扎贝特显著上调PDK4基因表达，该上调作用可被PPARα拮抗剂MK886明显抑制。推测苯扎贝特发挥降脂作用后，脂肪酸利用率加快，体内储存减少，PPARα激活PDK4后抑制糖酵解，使得肌肉蛋白质被分解用于提供能量，这可能是苯扎贝特引起肌病甚至横纹肌溶解症的作用机制。

综上所述，苯扎贝特作为PPARα配体对RD细胞具有明显的细胞毒性作用，PPARα及其下游基因PDK4发挥了重要的调节作用，但在此过程中PPARα活性是否发生变化仍需进一步探讨。

［1］ Bloomgarden ZT.Insulin resistance，dyslipidemia，and cardiovascular disease［J］.Diabetes Care，2007，30(8):2164-2170.

［2］ Chapman MJ.Fibrates in 2003:therapeutic action in atherogenic dyslipidaemia and future perspectives［J］.Atherosclerosis，2003，171(1):1-13.

［3］ Ansquer JC，Foucher C，Aubonnet P，Le Malicot K.Fibrates and microvascular complications in diabetesinsight from the FIELD study［J］.Curr Pharm Des，2009，15(5):537-552.

［4］ Gavish D， Leibovitz E， Shapira I， Rubinstein A.Bezafibrate and simvastatin combination therapy for diabetic dyslipidaemia:efficacy and safety［J］.J Intern Med，2000，247(5):563-569.

［5］ Hodel C. Myopathy and rhabdomyolysis with lipidlowering drugs［J］.Toxicol Lett，2002，128(1-3):159-168.

［6］ Chawla A， Repa JJ， Evans RM， Mangelsdorf DJ.Nuclear receptors and lipid physiology:opening the X-files［J］.Science，2001，294(5548):1866-1870.

［7］ Evans RM， Barish GD， Wang YX. PPARs and the complex journey to obesity［J］.Nat Med，2004，10(4):355-361.

［8］ 师凌云，田 蜜，常 伟，袁 野，周岐新.小檗碱对脂质代谢相关基因PPARα和CPTIA表达的影响［J］.中国药理学通报，2008，24(11):1461-1464.

［9］ Sugden MC，Holness MJ.Mechanisms underlying regulation of the expression and activities of the mammalian pyruvate dehydrogenasekinases［J］. Arch Physiol Biochem，2006，112(3):139-149.

［10］ Rardin MJ， Wiley SE， Naviaux RK， Murphy AN，Dixon JE.Monitoring phosphorylation of the pyruvate dehydrogenase complex［J］.Anal Biochem，2009，389(2):157-164.