何 娜，孙安盛，吴 芹，黄燮南，石京山

(遵义医学院1.药理学教研室，2.贵州省基础药理重点实验室，贵州遵义 563000)

心肌肥厚是发生心血管疾病的独立危险因素，而心肌细胞肥大是心肌肥厚重要的细胞病理学基础，阐明其发生及调控机制对心血管疾病的防治具有重要意义。钩藤碱(rhynchophylline，Rhy)是常用中药钩藤〔Uncaria rhynchophylla(Miq.)Jackson〕中的主要生物碱，本研究室已报道钩藤碱具有抑制血管平滑肌细胞增殖、舒张血管和抗脑缺血再灌注损伤等作用［1－4］。降压药物若兼有抑制心肌肥厚的效应，将能明显增加其临床应用价值。本研究应用体外培养的新生乳大鼠心肌细胞，研究Rhy对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)所致心肌细胞肥大的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂

新生SD乳大鼠，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，动物许可证:SCXK(军)2007-017。Rhy，由广西中药研究所提供，高效液相法检测纯度为96%;AngⅡ和5'-溴脱氧尿苷(5-bromo-deoxyuridine，BrdU)购自Sigma公司;DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公司;钙离子荧光探针Fluo-3/AM购自Biotium公司;RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、一氧化氮(nitric oxide，NO)和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所;β肌动蛋白、心房利钠因子(atrial natriuretic factor，ANF)、钙调神经磷酸酶(calcineurin，CaN)、细胞外信号调节激酶2(extracellular signal-regulated kinase 2，ERK2)和内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)引物购自大连宝生物公司，引物序列见表1;荧光定量PCR混和液购自英国ABI公司。

1.2 原代乳大鼠心肌细胞培养及给药

无菌条件下取出生后1～3 d乳大鼠心脏，将心室在预冷的 D-Hank液中剪成1～3 mm3小块，以0.125%的胰蛋白酶消化成细胞悬液，过滤，1000×g离心10 min，用含20%胎牛血清的DMEM培养液重悬浮，在37℃，5%CO2孵箱中差速贴壁 90 min后，取上清，细胞培养前 48 h加入终浓度为0.1 mmol·L－1BrdU抑制非心肌细胞增殖，然后换无胎牛血清的DMEM同步化24 h。制备的心肌细胞经抗α肌动蛋白免疫组化鉴定，纯度达95%以上，可用于实验。实验分为对照组(不含血清的DMEM培养基)、模型组(AngⅡ 0.1 μmol·L－1)和 Rhy 1，3 和10 μmol·L－1组(加入 Rhy 30 min 后加入 AngⅡ 0.1 μmol·L－1)，加入 Rhy 作用 48 h 后用于各指标的检测。

1.3 心肌细胞表面积的测量

将培养的心肌细胞以5×108L－1密度接种于含有盖玻片的6孔板中，各组给予不同浓度的Rhy，48 h后进行HE染色，采用Leica Qwin V3图像分析系统测量心肌细胞的表面积。随机选取5个视野，每个视野随机测定10～15个细胞，每组重复3次。

1.4 心肌细胞总蛋白质含量的测定

心肌细胞以5×108L－1密度接种于24孔板中，各组加入不同浓度的Rhy，48 h后吸弃培养基，用PBS洗3次。加入RIPA裂解缓冲液后收集心肌细胞，冰浴下超声破碎细胞，4℃，14 000×g离心30 min，取上清液按检测试剂盒说明操作，计算每孔心肌细胞的蛋白质含量。

1.5 心肌细胞［Ca2+］i测定

心肌细胞以1×108L－1密度接种于Petri皿中，各组加入 Rhy 0，1，3 和10 μmol·L－1，48 h 后无菌PBS洗3次，加入钙离子探针Fluo-3/AM(终浓度为5 μmol·L－1)置于37℃培养箱内孵 45 ～60 min，PBS轻洗3次，加入培养基，采用激光共聚焦显微镜每组随机选择30个细胞进行动态扫描，通过分析软件分析细胞内钙离子荧光强度。

1.6 细胞培养上清液NO含量和NOS活性的测定

心肌细胞以3×109L－1密度接种于25 ml无菌培养瓶内，各组加入 Rhy 0，1，3 和 10 μmol·L－148 h后，收集细胞上清液，据NO和NOS测定试剂盒说明书测定NO含量和NOS活性。

1.7 实时荧光定量PCR检测基因的表达

心肌细胞以3×109L－1密度接种于25 ml无菌培养瓶内，Rhy组加入 Rhy 0，1，3 和10 μmol·L－1，培养48 h后按Trizol法提取心肌细胞总RNA，用紫外分光光度计于波长260 nm和280 nm检测吸光度(A)，A260nm/A280nm值为 1.8 ～2.0。按逆转录试剂盒说明将其逆转录为cDNA并稀释，进行PCR扩增。以β肌动蛋白为内参基因，采用 2－ΔΔCt法计算ANF，CaN，ERK2和eNOS基因的相对表达水平。

1.8 统计学分析

表1 荧光定量PCR基因扩增引物序列Tab.1 Primer sequences for PCR gene amplification

2 结果

2.1 钩藤碱对血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大的影响

由表2 结果可见，AngⅡ 0.1 μmol·L－1使心肌细胞表面积增至对照组的2.8倍，蛋白质含量增至1.4 倍(P ＜0.01)。Rhy 1，3 和 10 μmol·L－1显著抑制AngⅡ诱导的心肌细胞表面积增大和蛋白质含量增加，对心肌细胞表面积的抑制率分别为50%，57%和61%(P＜0.01)，对蛋白质含量的抑制率分别为7%，10%和23%(P ＜0.05，P ＜0.01)。实时荧光定量PCR检测结果显示，正常心肌细胞ANF mRNA 基础表达较低，AngⅡ 0.1 μmol·L－1组 ANF mRNA的表达增加至对照组的4.7倍(P＜0.01);Rhy 1，3 和10 μmol·L－1对 AngⅡ诱导的 ANF mRNA表达增加具有抑制作用，抑制率分别为42%，56%和66%(P ＜0.05，P ＜0.01)。

2.2 钩藤碱对血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大细胞［Ca2+］i的影响

图1和表3结果显示，与对照组比较，AngⅡ0.1 μmol·L－1明 显 增 加 心 肌 细 胞 ［Ca2+］i(P ＜0.01);与 AngⅡ组比较，Rhy 1，3 和 10 μmol·L－1显著抑制［Ca2+］i增加随Rhy浓度的增加，钙离子荧光强度逐渐减弱，呈浓度依赖性，抑制率分别为15%，20%和28%(P ＜0.01)。

表2 钩藤碱(Rhy)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心肌肥大细胞的表面积，蛋白质含量和心房利钠因子(ANF)mRNA表达的影响Tab.2 Effects of rhynchophylline(Rhy)on cell surface area，protein content，atrial natriuretic factor(ANF)mRNA of hypertrophic cardiomyocytes induced by angiotensinⅡ(AngⅡ)

图1 钩藤碱对血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大细胞胞内游离钙离子浓度(［Ca2+］i)的影响(Fluo-3荧光染色 ×400).心肌细胞处理见表2.A:正常对照组;B:AngⅡ0.1 μmol·L －1(模型)组;C:AngⅡ+Rhy 1 μmol·L －1;D:AngⅡ+Rhy 3 μmol·L －1;E:AngⅡ+Rhy 10 μmol·L －1组.Fig.1 Effect of rhynchophylline on concentration of intracellular free calcium(［Ca2+］i)of cardiomyocyte hypertrophy induced by angiotensinⅡ (Fluo-3 fluorescence staining ×400).

表3 钩藤碱对血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大细胞内［Ca2+］i的影响Tab.3 Effect of rhynchophylline on［Ca2+］ion angiotensinⅡ-induced hypertrophic cardiomyocytes

2.3 钩藤碱对血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大细胞一氧化氮含量和一氧化氮合酶活性的影响

由表4可见，与正常对照组比较，AngⅡ 0.1 μmol·L－1降低心肌细胞NO含量和NOS活性(P＜0.01)。与 AngⅡ组比较，Rhy 1，3 和 10 μmol·L－1显著促进心肌细胞NO的释放，并升高NOS的活性(P ＜0.01);Rhy 10 μmol·L－1时，NO 含量和 NOS活性均为 AngⅡ组的2.3 倍(P ＜0.01)。

2.4 钩藤碱对心肌细胞中钙调神经磷酸酶、细胞外信号调节激酶2和内皮型一氧化氮合酶基因表达的影响

由表5结果可见，与正常对照组比较，AngⅡ0.1 μmol·L－1显著增加 CaN 和 ERK2 mRNA的表达，降低NOS mRNA的表达(P ＜0.01);与 AngⅡ组比较，Rhy 1，3 和 10 μmol·L－1明显抑制 CaN 和ERK2 mRNA 表达(P ＜0.05，P ＜0.01)，Rhy 3 和10 μmol·L－1明显升高 NOS mRNA 表达;Rhy 10 μmol·L－1对CaN mRNA和ERK2 mRNA表达的抑制率分别为60%和42%，eNOS mRNA表达为AngⅡ组的2.3 倍(P ＜0.01)。

表4 钩藤碱对一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性的影响Tab.4 Effects of rhynchophylline on content of nitric oxide(NO)and activity of nitric oxide synthase(NOS)on angiotensinⅡ-induced hypertrophic cardiomyocytes

3 讨论

在心肌肥大形成的病理过程中，AngⅡ是重要的体液因子，可引起心肌细胞的肥大以及细胞间质的堆积，从而导致心肌肥大［5］。现已普遍认为AngⅡ是经典的心肌细胞肥大的诱导剂。本研究采用AngⅡ为诱导剂，用HE染色观察心肌细胞的形态，发现AngⅡ明显增加心肌细胞体积、细胞肿胀和分界不清等肥大的病理改变;同时测得心肌细胞表面积和细胞内蛋白质含量明显增加。近年研究还表明，ANF已被确认为是心肌肥大的标志［6］。本研究发现，AngⅡ还明显增加ANF mRNA的表达，进一步证实本研究心肌细胞肥大模型建立成功。Rhy呈浓度依赖性地抑制AngⅡ诱导的心肌细胞表面积和蛋白质含量的增加，并抑制AngⅡ诱导的ANF mRNA表达，呈明显抑制心肌细胞肥大的作用。

表5 钩藤碱对血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大细胞钙调神经磷酸酶(CaN)，细胞外信号调节激酶2(ERK2)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因表达的影响Tab.5 Effects of rhynchophylline on gene expressions of calcineurin(CaN)，extracellular signal-regulated kinase 2(ERK2)and endothelial nitric oxide synthase(eNOS)in angiotensinⅡ-induced hypertrophic cardiomyocytes

近年研究表明，心肌细胞［Ca2+］i增加是导致心肌肥大的最基本信号［7］，心肌细胞内［Ca2+］i增高可激活 Ca2+敏感的 CaN，活化 T细胞核因子3(nuclear factor of activated T cells 3，NFAT3)和锌指转录因子，进而活化多种心肌肥大相关基因如ANF等的表达，促进心肌肥大。NO可通过激活鸟苷酸环化酶而抑制L型Ca2+内流，最终减弱NFAT核移位和转录活性而减轻心肌肥大。已有报道，NO能抑制心肌细胞和血管平滑肌的分裂和增殖，具有抗心肌肥大的作用［8－9］。Rhy 具有钙通道阻滞作用［2］。本研究结果显示，Rhy能明显抑制AngⅡ作用下心肌细胞［Ca2+］i的升高，增强NOS的活性，促进NO的释放，同时增加AngⅡ诱导的肥大心肌细胞eNOS mRNA的表达，抑制CaN mRNA的表达，表明其抗心肌细胞肥大作用可能与其抑制CaN通路有关。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路是AngⅡ诱导的心肌细胞肥大反应的另一重要的胞内信号传导通路，主要包括ERK、c-Jun N端激酶/应激活化蛋白激酶(c-Jun N-terminalkinase/stress activated protein kinase，JNK/SAPK)和MAPK p38。其中ERK1/2是重要的MAPK家族成员，也是细胞因子和生长因子介导细胞增殖中最重要的信号传导途径［10］。MAPK被其上游MAPK激酶ERK1/2磷酸化才具有活性，促进心肌细胞肥大。本研究表明，Rhy抑制了AngⅡ诱导的ERK2 mRNA表达，表明其抗心肌细胞肥大作用可能也与其抑制MAPK/ERK通路有关。

NO能抑制心肌细胞和血管平滑肌的分裂和增殖，具有抗心肌肥大的作用［7－8］。本研究结果显示，Rhy能提高AngⅡ作用下心肌细胞NOS的活性，促进NO的释放;同时增加AngⅡ诱导的肥大心肌细胞eNOS mRNA的表达，Rhy这一作用可能是其抗心肌细胞肥大的原因之一。

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