李志勇，孙建宁，张硕峰

(1.北京中医药大学中药学院中药药理系，北京 100102;2.中央民族大学中国少数民族传统医学研究院，北京 100081)

次乌头碱(hypaconitine，HA)是乌头类植物中3种主要的双酯型生物碱之一，与乌头碱类似，含有14位苯甲酸酯及8位醋酸酯的化学结构［1］。HA对小鼠的LD50弱于乌头碱和中乌头碱，而乌头碱与中乌头碱的毒性相似［2］。对15种附子炮制品的乌头碱、中乌头碱和HA含量进行检测发现，三者含量差异悬殊，部分炮制品的乌头碱和中乌头碱含量低于极限检测水平，而HA在15种受检炮制品中仍能检出，只是含量较低，推测乌头碱、中乌头碱和HA在附子炮制过程中均易分解，乌头碱对热最不稳定，而HA在炮制过程中的分解速度相对缓慢［3－4］。边宝林等［5］还发现，附子在煎煮过程中，HA的溶出量最高。上述结果提示，在3种双酯型生物碱中，HA在乌头属药材的炮制和煎煮等加工过程中不易被破坏，含量相对最高。因此，在细胞水平观察HA的毒性反应，对于全面了解乌头属药材的毒性作用，深入探讨HA在乌头属药材质量控制中的应用价值具有重要意义。但目前尚无关于HA心肌细胞毒性的研究报道。本研究将在细胞水平观察HA对原代培养的乳大鼠心肌细胞的毒性损伤作用。

1 材料与方法

1.1 动物和药品

出生3 d内的SD乳大鼠，雌雄兼用，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号:SCXK(京)2002-0003。HA纯度≥98%，购自中国药品生物制品检定所，批号:200404，用DMSO溶解，制成贮备液，使用时用DMEM/F12培养基配制成相应浓度。

1.2 试剂和仪器

DMEM/F12培养基和锥虫蓝(trypan blue)，美国Sigma公司;DMSO、胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶(collagenaseⅡ，CoⅡ)，美国 Amresco 公司;5-溴-2'-脱氧尿核苷(5-bromo-2'-deoxyuridine，BrdU)，瑞士Roche公司产品，由北京拜尔迪生物公司分装;胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司;小鼠抗大鼠α横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)，兔抗大鼠纤连蛋白多克隆抗体和生物素标记羊抗小鼠IgG抗体、生物素标记羊抗兔IgG抗体及即用型SABC免疫组织化学试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性测定试剂盒，南京建成生物工程研究所;其他试剂均为分析纯，北京化工厂。RCO-3000T-5V型CO2恒温培养箱，美国G.S.公司;DMIL HC倒置相差显微镜，德国Leica公司;ECLIPSE80i型正置荧光生物显微镜，日本Nikon公司;Image-Pro Plus 5.1图像分析软件，Media Cybernetics公司;UV-2000型紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司。

1.3 原代心肌细胞的制备与培养

按文献［6］方法，进行改良。无菌条件下取出乳大鼠心脏，在预冷D-Hank液中清洗3～4次。将心肌组织剪为1 mm3大小，加入3倍体积的消化酶(终浓度均为0.04%的胰酶和CoⅡ混合液，用前混匀)，于37℃，空气浴下以每分钟30～40次的速率振荡10～20 min，反复至消化完全;除第一次外，收集各次消化后的上清液，加入等体积含10%胎牛血清的DMEM/F12终止消化，于4℃，91.8 ×g 离心10 min，收集所有细胞，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，吹打成单细胞悬液，经200目尼龙网过滤去除未消化的组织块。接种于25 cm2的卡式培养瓶中，置于37℃，5%CO2饱和湿度孵箱中，差速贴壁法分离非心肌细胞;每次90 min，共2次。所得未贴壁细胞即心肌细胞，计数。按实验需要接种于培养板或培养瓶内，培养液中加入终浓度为0.1 mmol·L－1的 BrdU 抑制成纤维细胞增殖，加双抗(100 kU·L－1青霉素，100 kU·L－1链霉素)预防细菌污染，37℃，5%CO2，91%湿度环境中培养，36 ～48 h 换液1次，培养3～4 d后使用。

1.4 心肌细胞的鉴定

1.4.1 心肌细胞形态的观察

细胞培养3～4 d后，倒置显微镜下观察细胞形态。

1.4.2 锥虫蓝染色法检测心肌细胞存活率［7］

取细胞悬液 100 μl，加 100 μl 0.4% 锥虫蓝，无血清培养液或PBS 800 μl，在Eppendorf管内充分混匀，3 min内用血球计数板镜下分别计数活细胞和死细胞。死细胞被染成淡蓝色，活细胞拒染。细胞存活率(%)=活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。

1.4.3 心肌细胞的免疫化学鉴定

制备的细胞培养4 d后弃培养液，预冷(－20℃)甲醇和丙酮液(1∶1，V/V)固定过夜。将待测心肌细胞分为2组，在24孔培养板，分别滴加小鼠抗大鼠α横纹肌肌动蛋白多克隆抗体和兔抗大鼠纤连蛋白多克隆抗体，室温孵育2 h后再分别滴加生物素标记的羊抗小鼠IgG和羊抗兔IgG抗体，室温孵育20 min，按试剂盒说明书继续加入SABC复合物，DAB显色，蒸馏水终止显色反应。苏木素核复染，脱水，透明，封片，镜下观察。α横纹肌肌动蛋白仅存于心肌细胞和横纹肌，不存在于平滑肌，α横纹肌肌动蛋白免疫反应阳性的细胞即心肌细胞。心肌细胞上无纤连蛋白，纤连蛋白免疫反应阴性，表明没有其他细胞污染。

1.5 心肌细胞搏动频率的测定［8］

心肌细胞接种于25 cm2卡式培养瓶中，每瓶4 ml，密度为1×109L－1。培养4 d后，给药前30 min更换无血清的培养基，在倒置显微镜下记录30 s内细胞搏动次数，计算波动频率。随后分为培养基对照，HA 3，6，30，60 和120 μmol·L－1组，分别在给药后5，15，30 和60 min用相同方法记录细胞波动频率。每瓶随机选取3个视野。实验重复4次。

1.6 心肌细胞形态观察

心肌细胞接种于25 cm2卡式培养瓶中，每瓶4 ml，密度为1×109L－1。培养3 d后，给药前12 h更换无血清的培养基。根据1.5实验结果，以HA体外导致心肌细胞搏动频率消失的终浓度为最高浓度，将细胞随机分为 HA 30，60 和120 μmol·L－1组和培养基对照组，在倒置显微镜下分别观察给药后15，30，60和120 min心肌细胞形态的变化。

1.7 心肌细胞乳酸脱氢酶漏出率的测定

心肌细胞接种于48孔板，每孔500 μl，细胞密度1×109L－1。培养3 d后，给药前12 h更换无血清培养基。实验分组同1.6，并增设DMSO对照组。HA 30，60 和 120 μmol·L－1组加入含 HA 无血清培养基，分别孵育15，30和60 min，吸取培养基，4℃保存。在48孔板内再加入无血清培养基500 μl，置于－20℃冷冻4 h后化冻。分别取等体积第一次获得的培养基和冻融液，按试剂盒说明书测定LDH活性，计算LDH漏出率。LDH漏出率(%)=培养液LDH活性/(培养液LDH活性+冻融液LDH活性)×100%

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 制备的心肌细胞质量鉴定

在倒置显微镜下观察，刚接种的心肌细胞尚未贴壁，呈圆形，悬浮于培养液中。培养36～48 h后，心肌细胞已全部贴壁生长，细胞核凸出明显，贴壁后细胞为梭形、菱形或多角形，伸出伪足，形成不规则的星形并形成呈放射状排列的细胞簇，可出现自发节律性搏动。心肌细胞平均存活率≥90%。经免疫化学染色法分析，心肌细胞α横纹肌肌动蛋白免疫反应阳性(图1A)，纤连蛋白免疫反应阴性(图1B)。上述结果表明，制备的心肌细胞质量满意，可用于后续实验。

图1 原代培养的心肌细胞鉴定(免疫组织化学法 ×400).A:抗α横纹肌肌动蛋白抗体免疫染色，阳性;B:抗纤连蛋白免疫染色，阴性.Fig.1 Identification of primary cultured cardiac cells(Immunohistochemistry ×400).

2.2 次乌头碱对心肌细胞搏动频率的影响

心肌细胞正常培养4 d后，自发搏动频率为40～50 min－1。心肌细胞经无血清培养基培养60 min后，细胞的自发搏动频率呈下降趋势。HA 3 μmol·L－1作用5～30 min对心肌细胞搏动频率无明显影响;作用60 min时心肌细胞搏动频率与同一时间点的对照组比较明显升高(P＜0.05)。HA 6和30 μmol·L－1使心肌细胞搏动频率加大，与给药前比较，作用5～30 min时搏动频率快速增加(P＜0.01，P＜0.05)，类似抽搐状态，与同一时间点的对照组比较，细胞搏动频率亦显著增加(P＜0.01，P＜0.05);HA 60 μmol·L－1作用 5 min 与给药前及同一时间的对照组比较;心肌细胞搏动频率加快(P＜0.05);15 min时恢复到对照组水平，30～60 min时心肌细胞搏动频率明显减慢，并有停搏现象。HA 120 μmol·L－1给药后心肌细胞立即有停搏现象(表1)。

2.3 次乌头碱对心肌细胞乳酸脱氢酶漏出率的影响

表2结果显示，与DMSO对照组比较，HA 30，60和120 μmol·L－1作用 15，30 和 60 min 后，LDH 漏出率增多(P＜0.01);表明心肌细胞膜通透性改变，细胞受损，但未表现出完全的量-效与时-效关系。

2.4 次乌头碱对心肌细胞形态的影响

由图2可见，心肌细胞培养48 h后全部贴壁生长，细胞核凸出明显，贴壁后细胞为梭形、菱形或多角形，伸出伪足，形成不规则的星形并形成呈放射状排列的细胞簇，可出现自发节律性搏动。将含有HA的无血清培养基与心肌细胞共同孵育，随着HA浓度增加和作用时间延长，镜下可见心肌细胞的胞体折光性下降，胞浆皱缩变小，伪足减少，突起缩短;细胞表面呈泡状突起，形成类似“菜花状”的大泡;胞浆内黑褐色的沉着斑点增多，部分细胞脱壁死亡，特别是 HA 120 μmol·L－1作用 120 min 时镜下可见折光性强的死亡细胞。

表1 次乌头碱(HA)对原代培养心肌细胞搏动频率的影响Tab.1 Effect of hypaconitine(HA)on spontaneous beating rate of primary cultured cardiac cells

表2 HA对原代培养心肌细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出率的影响Tab.2 Effect of HA on release rate of lactate dehydrogenase(LDH)of primary cultured cardiac cells

图2 HA与心肌细胞作用15(A)和120 min(B)对细胞形态的影响 (×10).细胞处理见表1.1～4:HA 0，30，60和120 μmol·L－1.Fig.2 Effect of HA on modality of cardiac cells cultured for 15(A)and 120 min(B)(×10).

3 讨论

本研究制备的乳大鼠心肌细胞经锥虫蓝拒染法鉴定心肌细胞存活率大于90%。心肌细胞培养48 h后开始贴壁，镜下呈梭形、菱形或多角形，伸出伪足，形成呈放射状排列的细胞簇，并有自发节律性搏动。培养48 h后，用抗α横纹肌肌动蛋白和抗纤连蛋白多克隆抗体进行免疫化学染色，心肌细胞α横纹肌肌动蛋白免疫染色阳性，纤连蛋白免疫反应阴性。说明本研究制备的心肌细胞可用于细胞毒性实验。

本研究结果表明，HA对心肌细胞具有毒性作用，损伤程度与HA的浓度和作用时间有一定关联。HA 6 ～30 mmol·L－1，作用5 ～30 min 内即引起心肌细胞搏动频率加快，并偶见搏动频率不齐现象;作用时间60 min后，心肌细胞的搏动频率逐渐减弱，HA 30 mmol·L－1可同时引起细胞LDH漏出率增加;HA 60 mmol·L－1在作用5 min时引起心肌细胞搏动频率增加，随着作用时间的延长，实验中观察到心肌细胞搏动频率恢复，并有搏动减缓及停搏发生，LDH漏出率增加;HA 120 mmol·L－1给药后立即导致心肌细胞停搏，并在较短的时间(5～30 min)内使心肌细胞膜受损，LDH漏出率增加。HA 60 mmol·L－1作用120 min后，镜下可见个别心肌细胞出现脱壁死亡现象。本研究结果提示HA参与了心肌细胞的毒性损伤过程，在细胞水平，HA 30 ～120 mmol·L－1均能引起显著的心肌细胞毒性，表现为心肌细胞搏动频率改变、LDH漏出率增加及细胞脱壁死亡等。本研究从细胞水平初步阐明HA对心肌细胞具有毒性作用。有关HA体内给药对动物心功能的影响及HA心肌毒性的分子机制尚需进一步研究。

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