刘志礼 罗庆丰 黄山虎 周 扬 王 高 邹平安 舒 勇

骨肉瘤是好发于青少年的1种恶性程度很高的侵袭性疾病，虽然随着化疗药物的发展，生存率有了较大的提高，但是行截肢及化疗后仍有约40%患者死于肿瘤肺转移［1］，根本原因是80% ～90%的患者在确诊时全身微病灶转移就已存在［2］，所以早期发现肿瘤转移是影响肿瘤治疗效果的重要因素，所以寻找1种参与肿瘤远处侵袭及转移的标记物为早期判断肿瘤是否发生远处转移是非常重要。我们采用免疫组织化学染色的方法，检测FASN和p97蛋白在骨肉瘤组织中的表达，以了解它们在骨肉瘤的发生与转移中的作用，为进一步研究其参与骨肉瘤远处转移提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 标本来源与病例资料

选取南昌大学一附院、江西省肿瘤医院、江西省人民医院、浙江省余姚市人民医院2002年至2009年经手术切除的骨肉瘤组织标本60例:其中有肺转移者13例，口腔转移1例;男性34例，女性26例;年龄7～74岁，平均年龄18.4岁;骨母细胞型36例，纤维母细胞型15例，软骨母细胞型9例;股骨远端26例，胫骨近端16例，腓骨近端7例，肱骨近端7例，上颌骨2例，额骨2例。全部标本均经临床、影像学及病理组织学检查确诊为骨肉瘤。手术前所有病例均未经放疗及化疗，术前均行肿瘤局部X线摄片、肺部CT、胸片、全身骨扫描等检查。以21例骨软骨瘤作为对照组。

1.2 方法

采用免疫组化SP法，兔抗FASN、p97多克隆抗体为Santa Cruz公司产品，购自北京中杉金桥生物技术有限公司，以已知阳性组织切片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照，按1∶800稀释;二抗兔/鼠双标ChenMate TM EnVision HRP试剂盒购自Gene Company Limited;标本行免疫组化染色。常规脱蜡水化组织切片，组织抗原热修复pH 6.0柠檬酸缓冲液，微波高档20 min，10%山羊血清封闭，滴加一抗4℃过夜。滴加生物素标记的二抗室温育45 min，滴加辣根酶标记的链霉素卵白素，室温温育45 min。各步骤之间以PBS冲洗，5 min连续3次。DAB显色，苏木精复染，封片后在光镜下观察。

1.3 染色结果判定标准

FAS染色阳性表现为细胞胞质中出现棕黄色颗粒。采用半定量方法表达结果，将标本切片的染色强度和染色范围分别记分后相加，所得的分数即为最后的评分。评分方法参照 Pizer［3］，染色强度，0分:染色为阴性;1分:染色为弱阳性(浅棕色);2分:染色为阳性(棕色);3分:染色为强阳性(深棕色)。染色范围:0分为不显色;1分为阳性细胞数＜10%;2分为阳性细胞数11% ～50%;3分为阳性细胞数51% ～80%;4分为阳性细胞数≥81%。病理切片染色结果判定，由两名病理科医师盲法独立阅片完成，核对结果，取得共识。结果:①阴性表达:FAS评分＜4分为(－);②阳性表达:FAS评分≥4分;其中4分为(+)，5分为(++)，≥6分为(+++)。

1.4 统计学处理

应用SPSS13.0统计软件包，对所得的数据进行χ2检验，Spearman等级相关分析两蛋白之间的相关性。

2 结果

2.1 骨肉瘤组织中FASN和p97蛋白的表达情况

FASN和p97蛋白染色阳性物弥漫分布于细胞质中，呈深浅不一的棕黄色颗粒，p97蛋白在部分细胞核中亦有分布。在骨肉瘤和骨软骨瘤组织中FASN阳性表达率分别为60.0%(36/60)和28.6%，(6/21)有统计学差异(P＜0.05);p97蛋白在骨肉瘤与骨软骨瘤中阳性表达率分别为68.3%(41/60)和8.1%(4/21)，有统计学差异(表1)。

2.2 骨肉瘤组织中FASN和p97蛋白表达的相关性

骨肉瘤中FASN与p97蛋白表达程度的相关性分析，Spearman相关系数 γ =0.7，P ＜0.01(表1)。

2.3 FASN和p97表达与骨肉瘤远处转移的关系

发生远处转移骨肉瘤患者中FASN和p97蛋白阳性表达率分别为85.7% 和 92.9%，明显高于无远处转移骨肉瘤组织中 FASN(52.2%，24/46)和 p97(60.9%，28/46)阳性表达率，两者差异有显著意义(P＜0.05)，见表1。

2.4 FASN和p97表达与骨肉瘤病理组织学分型的关系

骨肉瘤组织中FASN和p97蛋白表达与骨肉瘤病理组织学分型无关(表1)。

表1 FASN、p97表达及其与骨肉瘤转移的关系

3 讨论

3.1 FASN与肿瘤的发生、发展

20世纪80年代末，有学者发现某些乳腺癌组织能够产生1种可与抗结合球蛋白抗体反应的蛋白质，称之为结合球蛋白相关蛋白(Hpr)或癌源性抗原OA519，该抗原与较差的预后密切相关，经过序列分析确定 Hpr就是脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FASN)。Menendez等［4］研究表明FAS在肿瘤细胞中对细胞生存的作用远远大于在正常细胞中的作用，且FASN表达强度与肿瘤的恶性程度密切相关，是1种新的癌基因。FAS是内源性脂肪酸合成的关键酶，广泛存在于动、植物组织细胞中，位于细胞胞质内，是1种大分子蛋白复合物，活性形式的FAS是以头尾相对排列的二聚体形式，具有包括缩合、转酰、还原、脱水在内的7种酶活性，能够催化丙二酰辅酶A、乙酰辅酶A和还原型辅酶Ⅱ体内合成为长链(16碳)饱和软脂酸盐，参与细胞的能量供给等多种生物学功能。除了哺乳期的乳腺和周期性的子宫内膜外，FAS在几乎所有的正常组织中都只是低水平的表达。而肿瘤细胞的脂肪酸合成却发生紊乱，已经发现多种组织来源的肿瘤细胞进行着过量的内源性脂肪酸的生物合成，肿瘤细胞的生长依赖于内源性的脂肪酸合成，从这些肿瘤组织中分离培养所得的细胞株也用内源性的脂肪酸完成多项生物学功能。而且脂肪酸合成酶在82%的因患恶性肿瘤而死亡的患者肿瘤组织中过度表达且具有高活性，在培养的肿瘤细胞或异种移植动物模型中，FASN的表达模式也与此相似［5］。FASN在肿瘤中的过度表达与磷脂酰肌醇23激酶/PTEN/AKt Kinase途径有关［6］。FASN在多种恶性肿瘤细胞中存在高表达［7～11］，并且发现 FASN 的高表达与膀胱、前列腺、乳腺等多种恶性肿瘤的组织分化及预后明显相关［12，13］。我们在前期小样本研究中［14～16］采用免疫组织化学法和Western Blotting方法，发现FASN在人骨肉瘤组织与细胞株U2-OS中高表达。在本研究中60骨肉瘤组织中FASN阳性表达率分别为60.0%(36/60)，而在骨软骨瘤组织中阳性表达率只有28.6%(6/21)，有统计学差异;但是骨肉瘤组织中FASN和p97蛋白表达与患者性别、年龄和WHO组织学分型无关。本研究中伴有骨肉瘤远处转移组FASN蛋白阳性表达率高达85.7%(12/14)，无远处转移组仅为 52.2%(24/46)，两者差异有显著意义，很可能FASN蛋白参与了骨肉瘤的远处转移，与文献报道的结果相似［17］。

3.2 p97蛋白与肿瘤

p97蛋白是1种对于细胞生存必不可少的蛋白质，在一些增生活跃的细胞中高度表达。它是ATP酶相关活性(AAA)超家族的成员，在细胞活动中主要起着分子伴侣的作用，参与膜的融合、转录活性的调节、细胞周期的调节、内质网相关蛋白的降解及介导细胞黏附、凋亡等生理病理过程。有文献报道［18～22］p97蛋白在多种恶性肿瘤中呈高表达，如食管癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌，并且参与肿瘤的远处转移。本研究中p97蛋白在骨肉瘤与骨软骨瘤组织中阳性表达率分别为68.3%(41/60)和 8.1%(4/21)，统计学差异明显，但是与骨肉瘤病理组织学类型无关;在伴有骨肉瘤远处转移组中p97蛋白阳性表达率为92.9%，明显高于无远处转移组(60.9%，28/46)，这也提示p97蛋白可能参与骨肉瘤的远处转移。

从本研究结果分析，FASN与p97蛋白在骨肉瘤组织中呈高表达，推测这2种蛋白很可能参与了骨肉瘤的发生，Murata等［23］通过动物实验研究发现，使用药物抑制FASN的表达和活性可以抑制直肠癌的肝转移发生率，说明FASN很可能参与了直肠癌的远处转移。另外，本研究还发现，FASN与p97在骨肉瘤组织中表达呈显著正相关，表明两者在骨肉瘤的发生和进展中很可能存在一定程度的协同效应，我们推测FASN和p97很可能参与了骨肉瘤的远处转移，可为骨肉瘤的基因及药物治疗的靶点。但是本研究因为转移组的样本量小，并且要说明某种蛋白是否参与肿瘤的远处转移还需要通过大量的实验来证实，本研究为进一步研究FASN和p97蛋白是否参与恶性肿瘤的远处转移和机制提供理论依据。

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