蒋艳萍 曹来英 洛若愚

宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)是与宫颈浸润癌密切相关的一组宫颈病理变化，包括CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ等一系列发生、发展的连续过程。人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染持续存在是宫颈上皮内瘤变进展的必须条件［1］。许多研究显示:与并发HPV感染但无宫颈病变患者比较，高级别CIN病变(CINⅡ和CINⅢ)患者外周血中抗HPV抗原的免疫反应降低［2］。然而，细胞因子在外周血和宫颈黏膜中的表达并非具有一致性［3］，宫颈组织的局部免疫反应在宿主抗HPV感染和宫颈病变的进展中也发挥重要作用［4］。近期研究表明，在多种人类肿瘤中，Treg细胞参与抑制免疫反应，与肿瘤免疫逃逸密切相关［5］，在宫颈癌的间质和上皮组织中表达增强［6］，参与疾病的发生。本研究检测CIN患者宫颈组织中Th1/Th2细胞因子免疫反应和Treg细胞水平的变化，为CIN的防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 病例选择

选择2009年7月～2010年5月我院收治的189例女性患者，平均年龄为(34.2±3.3)岁，81例(43%)为良性病变，60例(32%)为 CINⅠ，27例(14%)为CINⅡ，21例(11%)为CINⅢ。每位患者均行HPV检测、宫颈TCT检查及宫颈活检，根据组织学结果按病变程度分为良性病变、CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ四组。选择研究病例根据HPV高危型和CIN的病变程度。所有研究患者应排除以下条件:绝经期妇女、妊娠、慢性疾病(糖尿病、过敏、自身免疫性疾病)、急性感染、口服避孕药、使用镇痛药至少2周以上(非甾体抗炎药物)。HPV检测:宫颈组织样本收集后送医院检验科检测。

1.2 实验方法

1.2.1 标本采集 宫颈组织样本的收集用于细胞因子的检测［7］，简单的说，细胞刷样本放入RNA稳定剂中，储存于－80°C。细胞溶解于Trizol，RNA分离参照说明书进行。宫颈活检组织一部分用于病理检查，一部分制成单细胞悬液用于细胞和细胞因子的检测。

1.2.2 引物设计 从美国国立生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核酸数据库(Entrez Nucleotides database)中检索，应用设计软件Primer 5.0进行引物设计，然后将设计出的引物输入BLAST数据库中进行同源性比较，最终得到特异的引物序列。所有引物均由上海赛百胜生物公司合成。设计出的引物序列如下:IL-2 sense primer:5’-TATGCATCCGAGAC AATGGTTC-3’，IL-2 antisense primer:5’-CGAATTCTCAGACTTTAGGTGC-3’;IL-4 sense primer:5’-ACAAAAATCACTTGAGAGAGATCAT-3’，IL-4 antisense primer:5’-AGT TCCATTTGCATGATGCTCTT-3 ’;IFN-γ sense primer:5’-GAACGCTACACAC TGCATC-3’，IFN-γ antisense primer:5’-GA GCTCATTGAATGCTTGG-3’;IL-10 sense primer:5’-ACAGCTCAGCACTGCTCTG-3’，IL-10 antisense primer:5’-AGTTCACATG CGCCTTG-3’;IL-12 sense primer:5’GCCCAGCTGCTGAGGAGAGT-3’，IL-12 antisense primer:5’-TGGGTGGGTCAGGTTTGATG-3’;GAPDH sense primer:5’-ACAACAGCCT CAAGATCATCAG-3’，GAPDH antisense primer:5’-GGTCCACCACTGA CACGTTG-3’。

1.2.3 宫颈组织微量RNA的提取和逆转录合成CDNA 宫颈组织使用微量RNA提取试剂盒(QIAGEN)提取总RNA，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。用MBI逆转录试剂盒进行逆转录反应，反应体系为20 μl，全过程在冰上进行。

1.2.4 Q-PCR检测 实验中 Q-PCR所用染料为SYBR Green。反应条件均为95℃12 min，然后95℃15 s，60℃ 60 s，共45个循环。以GAPDH的表达量作为内参照。采用SYBR Green试剂可通过每1个PCR扩增反应中循环产物的荧光信号强度进行实时检测，从而记录产物量。

1.2.5 流式细胞仪检测宫颈组织中Treg细胞的变化

将收集的宫颈组织单细胞悬液计数，每样本细胞数应达到1×106个。检测Treg细胞，加入鼠抗人CD4-FITC单克隆抗体、鼠抗人CD25-PE单克隆抗体、鼠抗人CD127-ACEXA647单克隆抗体，室温孵育30 min。处理好的样品置流式细胞仪按常规进行分析，以相应的荧光标记的同型对照IgG1染色细胞作为阴性对照，应用EXPO2软件分析结果。

1.3 统计学分析

统计学分析采用InStat软件，数据以均数±标准差表示，采用χ2检验进行统计学处理。

2 结果

2.1 4组HPV检测结果

4组患者HPV检测的结果见表1。

表1 4组患者HPV检测情况(例，%)

2.2 Treg细胞表达的检测

统计学分析结果显示，CINⅡ 、CINⅢ患者宫颈组织(cervix biopsy，CB)中Treg细胞占CD4+T细胞比例分别为(7.0 ±1.3)%、(7.3 ±1.4)%，高于良性病变及 CINⅠ患者的(4.9 ±0.9)%和(5.4 ±1.1)%，P ＜0.05，有统计学意义，见图 1。

图1 4组宫颈组织中Treg/CD4+T细胞的比例

2.3 Th1/Th2细胞因子的检测

良性病变、CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ组宫颈组织(CB)中 IFN-γ 表达水平分别为(6.2 ±1.9) ×103、(5.7 ±1.6)×103、(4.2 ±1.1)×103、(3.9 ±1.0)×103拷贝，逐渐下降，其中良性病变和CINⅠ组高于CINⅡ和CINⅢ组，P＜0.05，有统计学意义。IL-10表达水平在良性病变、CINⅠ、CINⅡ 和CINⅢ组宫颈组织(CB)中分别为(3.1 ±0.9) ×103、(3.3 ±1.1) ×103、(4.7 ±1.3)×103和(5.0 ±1.6)×103拷贝，逐渐上升，且CINⅡ和CINⅢ组高于良性病变和CINⅠ组，P ＜0.05，有统计学意义。IL-2、IL-12 及 IL-4 表达水平在4组患者中无明显差异，见图2。

图2 4组宫颈组织中IFN-γ、IL-10表达情况

3 讨论

现已发现多种肿瘤患者体内Th2型细胞因子占优势状态，机体免疫反应向Th2偏移［8］。宫颈上皮内瘤变(CIN)是与宫颈浸润癌密切相关的一组宫颈病理变化，既往关于患者体内细胞因子变化的研究数据多来源于外周血。本文的研究显示:相比较正常良性病变和轻度CIN病变患者，中、重度CIN患者(CINⅡ 和CINⅢ)宫颈组织中 IFN-γ表达水平下降。IFN-γ由Th1型细胞、细胞毒性T细胞及活化的NK细胞分泌，介导有效的Th1型细胞免疫反应，对抗HPV感染。HPV持续感染与IFN-γ分泌下降密切相关，并引起宫颈内瘤病变的进展［9］。本文来源于宫颈组织中IFN-γ的研究结果与既往相关报道结果一致。其他的Th1型细胞因子如IL-2在4组患者宫颈组织中的表达无明显变化。

在宫颈内瘤变的发展过程中，通过外周血中Th2型细胞因子如IL-4和IL-10的高表达，使机体偏向于Th2型细胞免疫反应。在本文研究组患者的宫颈组织中，IL-4的浓度没有明显变化，IL-10的浓度随着CIN病变程度的增加而明显增加。IL-10在免疫抑制中发挥重要的作用，抑制T细胞的激活和Th1细胞的分化。有研究者报道，在中、重度的鳞状上皮病变中，IL-12∶IL-10的比例明显下降，表现为偏向于Th2型细胞免疫反应［10］。IL-12是细胞免疫中重要的免疫调节因子，它可以促进NK细胞和CTL的活性，能刺激T细胞及NK细胞的增殖，并诱导分泌多种细胞因子，尤其是IFN-γ。我们研究发现，随着CIN病变的进展，研究组患者宫颈组织中IFN-γ、IL-12、IL-2表达水平无明显变化或表达下降，与IL-10的比例呈明显下降趋势，支持和扩展了既往的一些研究结果，表明机体抗HPV感染的细胞免疫反应下降，导致CIN病变的进行性发展。

Treg 的表面标志为 CD4、CD25、FOXP3，这些表面标志在人类Treg细胞的检测中存在争议，研究表明CD4+CD25+CD127low/-可作为 Treg细胞检测的标志。既往关于Treg细胞和CIN病变的相关研究较少，有研究表明在CIN及宫颈癌患者外周血单核细胞或CD4+T细胞中Treg细胞比例增加，如果清除CD25+T细胞能提高HPV16 E6-和E7特异性辅助T细胞反应，表明内在的抗HPV反应存在［11］，并且Treg细胞参与调节免疫反应，研究显示了人体系统(外周血)中的Treg细胞数增加与HPV持续感染存在关联性。而我们的研究结果来源于局部宫颈黏膜水平，显示CIN病变患者宫颈组织中Treg细胞数增加，并随病变程度的加重呈渐进性增加;同时，CIN程度的增加，高危型HPV感染比例增加，宫颈黏膜组织中Treg细胞数增加亦与HPV的持续感染密切相关。既往的研究和本文的研究分别从系统水平和宫颈黏膜局部水平，支持了Treg细胞下调机体抗HPV感染的免疫反应这一假设，导致CIN病变的渐进性发展。

总之，在HPV感染引起的宫颈CIN病变的进展过程中，宫颈组织中细胞因子网络发生变化:IFN-γ表达水平下降，IL-10表达水平增高，表明了Th1/Th2平衡向Th2偏移;在宫颈黏膜中Treg细胞表达随CIN病变程度的增加而增加。细胞因子和Treg细胞的变化下调机体抗HPV感染能力和抗肿瘤免疫反应。因此，应用相应的免疫治疗等手段纠正机体的免疫紊乱，可能增强机体的细胞免疫功能，克服肿瘤细胞的免疫逃逸和免疫封闭，为防治HPV感染所致的癌前病变中提供治疗的靶点。

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