余玉红 陈出新 张 嘉

大肠腺瘤(colorectal adenoma)是大肠癌(colorectal carcinoma)的癌前期病变，80%以上的大肠癌由腺瘤恶变而来。从大肠腺瘤到癌的演变是由多基因参与的多阶段、多步骤改变并积累的复杂过程。转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)是一组具有调节细胞生长和分化功能的多肽类细胞因子，在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。目前认为，TGF-βl具有双向作用:在肿瘤发生早期，抑制肿瘤细胞的生长;但在肿瘤的中后期，TGF-βl在肿瘤细胞中的高表达，可能促进肿瘤的恶性特征。TGF-βl基因具有多态性，其第25位氨基酸密码子+915G/C多态性位于TGF-βl的信号肽区，与血清TGF-β1的浓度显著相关［1］。鉴于TGF-βl在肿瘤免疫调节中的重要作用，我们把TGF-βl基因作为大肠腺瘤和大肠癌的易感候选基因来研究。本研究探讨TGF-β1基因+915位点G/C多态性与大肠腺瘤及大肠癌易感性的关系，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

病例组:52例散发型大肠腺瘤病例及70例散发型大肠癌病例来自深圳市各级医院2007年1月～2009年8月经组织病理学确诊的住院患者，其中大肠癌病例采血时未行放射和化学治疗，分期标准采用Dukes改良分期。大肠腺瘤组男性28例，女性24例，平均发病年龄(43±12)岁。大肠癌组男性41例，女性29例，平均发病年龄(49±11)岁;其中结肠癌26例，直肠癌44例;组织学分型腺癌65例，黏液腺癌5例;Dukes分期A期14例，B期19例，C期20例，D期17例。对照组102例，来自深圳市第七人民医院的健康体检者，其中男性66例，女性36例，平均年龄(44±17)岁。以上研究对象均为无血缘关系的汉族人。该研究已经医院伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

1.2 基因分型

用蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提和乙醇沉淀的方法分离基因组DNA。按照Amani等［2］方法，从基因组DNA中扩增包含+915位点多态性的TGF-β1基因片段。据文献上游引物序列为5’GCTGCTACCGCTGCTGTGGC 3’，下 游 引 物 序 列 为 5’TGTTGTACAGGGCGAGCACGG 3’，由上海博亚生物技术有限公司合成。PCR反应总体积25μl，其中含灭菌双蒸水18.5 μl，10×PCR 反应缓冲液2.5 μl，上下游引物(10 μmol/L)各 1 μl，dNTPs(10 mmol/L)0.5 μl，TaqDNA聚合酶0.5 μl，模板 DNA 1 μl(约30 ～100 ng)。PCR反应在GeneAmp 2 400 PCR仪(Perkin Elmer公司)上进行。反应条件94℃变性5 min后，94℃ 40 s，57℃ 1 min，72℃ 1 min，30 个循环，最后 72℃延伸 5 min。扩增的DNA片段经2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察鉴定。限制性内切酶BglI(购自MBI)消化PCR产物。反应体系:PCR 产物10 μl，灭菌双蒸水7.5 μl，10×限制性内切酶反应缓冲液2.0μl，与5 U限制性内切酶BglI，于37℃水浴5 h，65℃加热10 min终止反应，用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析基因型。

1.3 血清TGF-βl水平的检测

用ELISA法测定血清TGF-β1水平。采用人TGF-β1测定ELISA试剂盒(美国R＆D公司产品，从深圳晶美生物工程有限公司购买)，收集血液，将血清冻存于－20℃的低温冰箱。具体操作步骤如下:分别加入标准品及样品各100μL，辣根过氧化物酶结合的TGF-β1 50μL，室温孵育2 h，弃上清液，再加入显色剂100 μL，室温孵育30 min终止反应。酶标仪读取A值。

1.4 统计学分析

以Hardy-Weinberg平衡检验确认研究样本的群体代表性，计算各组的基因型频率及等位基因频率。以χ2检验分析病例组和对照组TGF-β1基因型及等位基因分布的差异。以优势比(odds ratio，OR)及其95%可信区间(CI)表示相对风险度。P＜0.05认为有显著性统计学意义。计量资料以均数±标准差±s)表示，两组间比较采用t检验，P＜0.05认为有显著性统计学意义。统计在SPSS 11.5软件包中进行。

2 结果

2.1 TGF-β1 基因型检测结果

扩增的PCR产物约215 bp，用限制性内切酶BglI消化后，TGF-β1+915位点基因多态性共检测到3种基因型，分别为 GG(175 bp和40 bp)、GC(215 bp、175 bp和40 bp)、CC(215 bp)，见图1。其中40 bp片段较小，已移出胶外。经χ2检验，大肠腺瘤组，大肠癌组和正常对照组人群基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡。

图1 TGF－β1扩增产物被BglI酶切后的电泳结果

2.2 TGF-β1+915位点基因多态性比较

我们比较了大肠腺瘤组，大肠癌组和正常对照组TGF-β1+915位点基因多态性分布，发现TGF-β1+915位点基因型频率和等位基因频率在各群体的总体分布无显著差异(P＞0.05)，见表1。

表1 病例组和对照组TGF-β1基因+915位点G/C多态性分布

2.3 TGF-β1+915位点多态性与大肠腺瘤病变部位的关系

按病变部位将大肠腺瘤分为结肠腺瘤和直肠腺瘤后，未发现TGF-β1+915位点基因型频率和等位基因频率分布的差异(P＞0.05)，见表2。

表2 TGF-β1基因+915位点G/C多态性与大肠腺瘤病变部位的关系

2.4 TGF-β1+915位点多态性与大肠癌临床病理特征的关系

大肠癌病例分别按病变部位、分化程度、Dukes分期等临床病理特征分层后，未见TGF-β1+915位点基因型及等位基因频率分布存在显著性差异(P＞0.05)，见表3。在此基础上我们进一步分析比较了不同性别的大肠癌患者TGF-β1基因型在以上几种临床病理特征中的分布，均未发现显著性差异(P＞0.05)。

表3 TGF-β1基因+915位点G/C多态性与大肠癌临床病理特征的关系

2.5 病例组和对照组TGF-β1血清水平的比较

与对照组比较，大肠腺瘤和大肠癌组血清TGF-β1水平显著增高(分别 t=2.739，P ＜ 0.01;t=9.805，P＜0.01)，且大肠癌组血清TGF-β1水平显著高于大肠腺瘤组(t=4.285，P ＜0.01)。Dukes D 期 TGF-β1 血清水平显著高于Dukes A期(分别为 t=2.661，P=0.029)及 Dukes B 期(t=2.988，P=0.017)。见表4。

表4 病例组和对照组TGF-β1血清水平比较

2.6 病例组各基因型间TGF-β1血清水平的比较

大肠腺瘤组和大肠癌组TGF-β1+915位点各基因型间TGF-β1血清水平无显著型差异(P＞0.05)，见表5。

表5 病例组不同基因型间TGF-β1血清水平比较

3 讨论

人类编码TGF-βl的基因位于染色体19q13.1-3，其编码区域由7个外显子和6个内含子构成。目前发现TGF-βl基因至少存在9个单核苷酸多态性(SNPs)位点，它们的定位分别是-988(C＞A)、-800(G＞A)、-509(C＞T)、+72插入C、第4个内含子缺失c、第5个内含子内(C861-20T)、第10位氨基酸密码子T869C(CTG ＞CCG，Leu＞Pro)、第 25位氨基酸密码子G915C(CGG＞CCG，Arg＞Pro)、第263位氨基酸密码子C1632T(ACC＞ATC，Thr＞Ile)。其中已有文献报道［1，3，4］启动子区-509(C ＞ T)、第 1 外显子区第 10 氨基酸密码子T869C(Leu＞Pro)、第25氨基酸密码子G915C(Arg＞Pro)多态性的某些基因型与TGF-β1水平增高有关。

第25位氨基酸密码子G915C多态性(rs1800471)位点位于第1个外显子编码的TGF-β1的信号肽区，信号肽序列的改变可能影响蛋白质的转录和翻译，进而影响TGF-β1相关疾病的发生、发展和转归。Garcia-Gonzalez等［5］在142例西班牙胃癌患者中，未发现TGF-β1 G915C基因多态性与胃癌之间的相关性。Berndt等［6］对美国人的研究发现，－509TT和10Pro/Pro基因型与大肠腺瘤的高风险相关。其中－509TT基因型与多发性腺瘤及直肠腺瘤相关，而第25氨基酸密码子G915C(Arg＞Pro)和第5外显子区的第263氨基酸密码子C1632T(Thr＞Ile)多态性与大肠腺瘤无关。我们采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法检测了52例大肠腺瘤、70例大肠癌患者与102例正常对照者TGF-β1+915位点等位基因及基因型，总体分布未发现显著性差异。与国外研究相似，表明TGF-β1+915G/C基因多态性与患大肠腺瘤及大肠癌的风险无关。

TGF-β1具有双向作用:在肿瘤发生早期，TGF-β1起抑制作用，在肿瘤发生的后期TGF-β1则作为促癌因子直接作用于肿瘤细胞，通过刺激血管生成、增加瘤细胞与细胞外基质的相互作用以及抑制免疫系统等促进肿瘤的生长、浸润及转移［7］。大肠癌患者中TGF-β1血清水平增加且与肿瘤的分期或外科手术切除后的转移相关［6］。我们分析比较了TGF-β1不同基因型的大肠癌患者临床病理特征。不同性别、不同的病变部位、分化程度、Dukes分期等临床病理特征中TGF-β1基因型及等位基因频率分布无显著性差异。表明+915G/C基因多态性可能与大肠癌的进展无关。我们同时采用ELISA法检测了血清TGF-β1水平，发现大肠腺瘤组及大肠癌组血清TGF-β1水平显著高于对照组。Dukes D期血清TGF-β1水平显著高于Dukes A期(分别为 t=2.661，P=0.029)及 Dukes B 期(t=2.988，P=0.017)。可能的假说为:在肿瘤后期个体产生TGF-β1水平增高，从而促进肿瘤的浸润和转移。我们进一步比较了TGF-β1+915位点各基因型间TGF-β1血清水平，未发现显著型差异。表明TGF-β1血清水平可能与+915位点基因型无关。

我们检测的样本例数较少，尚需进一步扩大样本检测量，并完善TGF-β1其他多态性位点的检测，从而明确TGF-β1基因型与TGF-β1分子表达的关系。

［1］ Tag CG，Mengsteab S，Hellerbrand C，et al.Analysis of the transforming growth factor-beta1(TGF-beta1)codon 25 gene polymorphism by Light Cycler-analysis in patients with chronic hepatitis C infection〔J〕.Cytokine，2003，24(5):173.

［2］ Amani D，Dehaghani AS，Zolghadri J，et al.Lack of association between the TGF-β1 gene polymorphisms and recurrent spintaneous abortion〔J〕.JReprod Immunol，2005，68(1 ～2):91.

［3］ Eliopoulos DG，Mavroudi I，Pontikoglou C，et al.The-509C/T polymorphism of transforming growth factor-beta1 is associated with increased risk for developmentof chronic idiopathic neutropenia〔J〕.Eur JHaematol，2009，83(6):535.

［4］ Brezzi B，Del Prete D，Lupo A，et al.Primary IgA nephropathy ismore severe in TGF-beta1 high secretor patients〔J〕.J Nephrol，2009，22(6):747.

［5］ Garcia-Gonzalez MA，Strunk M，Piazuelo E，et al.TGFB1 gene polymorphisms:their relevance in the susceptibility to Helicobacter pylori-related diseases〔J〕.Genes Immun，2006，7(8):640.

［6］ Berndt SI，Huang WY，Chatterjee N，et al.Transforming growth factor beta 1(TGFB1)gene polymorphisms and risk of advanced colorectal adenoma〔J〕.Carcinogenesis，2007，28(9):1965.

［7］ Bruckheimer EM，Kypfianou N.Bcl-2 antagonizes the combined apoptotic effect of transforming growth factor-βand dihydrotestosterone in prostate cancer cells〔J〕.Prostate，2002，53(2):133.