丁 罡 黄 骞 陈学进 刘合代

肿瘤的生长和转移很大程度上依赖肿瘤血管形成［1，2］。血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)特异性地作用于血管内皮细胞上的硌氨酸受体，诱导血管内皮细胞分裂，增殖，向肿瘤细胞迁移，最后形成新生血管。大鼠脾内移植肝转移模型是肿瘤细胞转移实验研究理性的动物模型［3］。本实验通过该模型，观察在大鼠脾内移植瘤模型中VEGF表达与肿瘤血管形成、侵袭和转移的关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

Walker256癌肉瘤细胞株，由北京肿瘤研究所提供。Wistar雌性大鼠16只，体重(200±20)g，由上海斯莱克实验动物公司提供［许可证号:scxk(沪)2007－0005］。分笼饲养，室温 24℃ ～26℃，湿度 40% ～60%。

1.2 实验方法

Wistar大鼠Walker256癌肉瘤脾内移植后肝转移模型的建立［3］:抽取Wistar大鼠的Walker256腹水瘤，台盼蓝排除法计活细胞数。用PBS调整瘤细胞浓度为 5 ×107/ml。氯胺酮(30 mg/100g)0.4 ml/只腹腔注射麻醉大鼠。在大鼠的右侧腹部(脾区)消毒后，剪开约1 cm的小口，暴露脾脏并固定，用4号针头在脾的下极包膜下缓慢注入0.2 ml Walker256肉瘤细胞悬液。局部用凝血酶，明胶海绵压迫止血，然后逐层缝合腹肌、皮肤。

动物血清标本采集:在瘤株接种前后第2、14天，分别采取大鼠尾静脉血0.5 ml，2 000 rpn室温离心。取上清液200μl保存于－30℃。

肿瘤生长和转移分析:瘤株接种后第14天处死并解剖大鼠，观察肿瘤重量、肝内转移灶、腹腔转移灶和腹腔积液情况。

微血管密度计数［4］:选用兔抗大鼠FactorⅧ进行免疫组织化学染色。两位具有一定血管研究经验的人员观察，先在100倍光镜下寻找肿瘤中血管密度最高的5个区域，然后在200倍光镜下计算微血管密度(MVD)。5个区域的均值为该肿瘤的微血管密度。肿瘤组织中任何黄染的细胞或细胞群都计算为1个MVD，位于汇管区的血管不计算。

免疫组织化学判断标准［5］，染色强度:0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。阳性细胞数:无阳性细胞数为0分，阳性细胞数＜10%为1分，11% ～50%为2分，51% ～74%为3分，≥75%为4分。两者乘积＞3分为免疫反应(+)。按乘积分数:0分为(－)，1～3分为(±)，4～5分为(+)，6～7分为(++)，＞7分为(+++)。

2 结果

2.1 大鼠脾内移植瘤模型血清VEGF表达与肿瘤血管形成的关系

大鼠脾内移植瘤模型血清VEGF表达与肿瘤组织微血管密度、肝转移显著相关，γ=0.92 P＜0.05。肝转移大鼠肿瘤组织中的微血管密度大于肝转移阴性大鼠(86.82 ±11.39 vs 71.56 ±8.95，P ＜0.05)(图 1)。

2.2 VEGF在转移肿瘤中的表达

免疫组化结果显示，VEGF主要表达于肿瘤细胞胞质，染色阳性。发生肝转移的脾脏肿瘤细胞VEGF胞质染色较深。

2.3 大鼠移植瘤模型血清VEGF与肿瘤生长、转移的关系

大鼠移植瘤模型血清VEGF表达水平的变化见图2。大鼠移植瘤模型中血清VEGF表达与肝转移、腹腔播散和血性腹腔积液有关(表1)。

表1 大鼠肿瘤血清VEGF与肿瘤侵袭、转移的关系

图1 大鼠血清VEGF与肿瘤微血管密度、肝转移的关系

图2 大鼠移植瘤模型血清VEGF表达的变化

3 讨论

肿瘤细胞的生长和转移很大程度上依赖肿瘤血管形成。实体肿瘤生长到2～3 mm时，如果缺乏新生血管，肿瘤细胞即进入到休眠状态，如果血管形成，进入肿瘤组织后，肿瘤组织的血供即由弥散变成灌注。两天内，肿瘤细胞由静止状态开始加速生长，同时肿瘤周围环境继续血管化，血管形成，两周内肿瘤组织的体积可达原来19 000倍［6］。肿瘤血管为肿瘤细胞生长提供所需的营养，同时由于新生的肿瘤血管结构和功能异常，例如血管壁不完整，缺乏基膜等，使得肿瘤细胞能穿透管壁，进入血循环，发生远处转移。

近年来，实验中发现了许多肿瘤血管形成正负调节因子。其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)特异性地作用于血管内皮细胞上的硌氨酸受体，诱导血管内皮细胞分裂，增殖，向肿瘤细胞迁移，最后形成新生血管，使肿瘤病灶的氧供由弥散变为灌注，为肿瘤细胞的生长提供氧、营养、排泄、分解代谢产物［7］。通过增强血管通透性，使营养物质渗到肿瘤病灶和血浆蛋白(纤维蛋白)渗出血管腔，沉积于周围组织。有助于肿瘤血管形成和为肿瘤生长提供微环境［8］。血管形成为恶性肿瘤细胞进入血道发生远处转移创造条件。VEGF是已知作用最强、特异性最高的血管生长因子之一。

在实验大鼠移植瘤模型中随着大鼠血清VEGF浓度的升高，肿瘤组织中的微血管密度增大。并且肝转移大鼠MVD高于肝转移阴性大鼠。这与Takanamib报道的结果相似［9］，表明VEGF在一定程度上调控肿瘤血管形成。有实验表明，肿瘤的血管形成及血管密度与肿瘤的转移密切相关，从而影响肿瘤的预后［10，11］。

本实验发现大鼠接种瘤细胞24小时血清VEGF浓度明显升高，在以后的两周内血清VEGF浓度保持相对稳定的高水平，这是因为大鼠接种1×107个瘤细胞后，生长超过2～3 mm，此时肿瘤细胞生长须肿瘤血管支持［12］。肿瘤细胞即高度表达VEGF，使大鼠血清VEGF浓度明显升高，诱导内皮细胞分裂、增殖、降解基膜、趋化、最终形成肿瘤血管。

实验动物大鼠移植瘤模型出现肝转移、血性腹腔积液、腹腔播散的血清VEGF浓度和免疫组化染色也明显高于非侵袭和转移的大鼠，这表明在肿瘤发展过程中，只有当肿瘤细胞向侵袭、转移方向发展时，释放大量的VEGF，诱导肿瘤血管形成，产生转移。同时，检测血清VEGF水平的变化在一定程度反映肿瘤侵袭、转移的倾向。

本实验结果表明，在大鼠脾内移植瘤肝转移模型中，肿瘤细胞表达VEGF在肿瘤血管形成、肿瘤细胞的侵袭和转移中起重要作用。检测血清VEGF的表达有助于预测肿瘤的侵袭和转移，肿瘤预后判断，为临床针对VEGF靶点的抗肿瘤转移治疗提供理论依据。

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［12］ Folkman J，Cole P，zimmerman S.Tumor behavior in isolated perfused organs:In vitro growth and metastasis of biopsy material in rabbit thyroid and canine intestinal segment〔J〕.Ann Surg，1966，164:491.