近年来，随着广谱抗生素、免疫抑制剂等药物的广泛应用，真菌感染性疾病不断增多，故而其菌种鉴定在临床诊断、治疗中起着重要指导作用。真菌感染的诊断以往主要以形态学为依据，但这些方法费时费力，并且检测阳性率很低；目前飞速发展的分子生物学技术为病原真菌的生物学特性研究提供了可能，本文对这几种分子生物学技术的特点及在病原真菌鉴定分型研究中的应用进行综述。

1 多聚酶链式反应(PCR)

PCR技术是一种特异扩增DNA的体外酶促方法，可用于扩增位于两段已知序列之间的DNA。而改进的PCR技术如巢式PCR（nested PCR）、多重PCR(mutiplex PCR)、荧光PCR技术等则又在较大程度上增加了该技术的敏感性与特异性。近年来，PCR方法已渗透至临床检测的各个领域，并逐渐应用于真菌病的诊断中。

根据真菌的保守序列设计通用引物，用常规PCR方法进行扩增，判定感染真菌的种类则需应用属种的特异性引物。前者最常选用的靶基因是核糖体蛋白基因（rDNA），其亚基序列（18S和28S）相对保守，多用于设计真菌通用引物，比较成熟的引物有NS1、NS3、NS5、NS6、NS9等；后者则根据两个相对变异的内转录间隔区（ITS1和ITS2），或特异基因设计而成，直接鉴定至种，常用引物有ITS1、ITS2、ITS3、ITS4等。

Turenne[1]等采用荧光标记引物扩增种特异性ITS-2，结果证明对获自血液和组织的致病性真菌种水平上的区分有极好的效果。有国外学者用多重PCR测定法鉴定口腔念珠菌属，采用引物ITS1，ITS2，CA3和CA4进行检测，结果能准确检测出所有样本菌，比培养法准确。说明多重PCR是一种检测假丝酵母属的快速方法[2]。

2 聚合酶链反应-限制性片断多态性分析(PCR-RFLP)

又称限制性内切酶分析（REA），是指用限制性内切酶将DNA在特定的核苷酸序列上切割，由于不同生物个体酶切位点不同，故产生的DNA片段长度呈现多态现象，根据这种DNA的多态性图谱可进行种间和种内分型。原则上，只要内切酶选择合适，对所有真菌均能显示任何分类水平上的多态性和特异性。

Denning[3]等用该法对肺曲霉病患者体内分离的烟曲霉进行了DNA分型，结果提示多种类型的曲霉病可能由同一DNA型的烟曲霉引起，并且发现致病性烟曲霉菌群的分布与人类生活环境和自然环境密切相关。PCR-RFLP技术虽然快速、灵敏，但当检测的真菌较多时，由于单种限制性内切酶不能区分所有真菌，需要几种内切酶的联合使用，较耗时费力。

3 随机引物扩增 DNA多态性(RAPD)技术

又称任意引物聚合酶链反应(arbitrarily primed PCR)，RAPD技术是利用随机合成的单个寡核苷酸为引物（通常为10bp），通过PCR扩增靶细胞基因组DNA片段进行多态性分析，来比较不同个体基因组DNA组成的差异，进行基因定位，确定基因型，做出DNA指纹图等。这一方法适于病原真菌各秩级的分类与鉴定研究，因为病原真菌基因组庞大，目前许多基因操作技术只能了解其局部的情况，而RAPD却能对整个基因组序列作大致的了解。RAPD借用的基本方法是PCR技术，无需模板DNA的任何序列信息，不需对扩增产物进行酶切与测序，无需DNA探针，不涉及Southern杂交、放射自显影或其他技术，操作步骤少，实验周期短，能在较短的时间内筛选大量样品。但其重复性和特异性往往受反应条件的制约。该法可以在未知靶DNA序列的情况下进行，特别适用于分子生物学特征不明确或不了解基因组DNA序列的真菌，因此被广泛用于酵母菌和丝状真菌的分类和流行病学研究。

4 DNA序列分析

DNA序列分析能够获得DNA分子变异最本质、最可靠的信息，对于了解基因结构、表达及分子进化等具有重要意义。以DNA为对象的研究均是建立在基因序列差异的基础上，所以DNA序列分析是分子生物学研究中最根本的方法。该方法可用于设计探针、特异引物等对真菌病进行诊断。

真菌基因组中编码核糖体的基因有4种:18SrDNA、5.8SrDNA、28SrDNA、5SrDNA[4]。包括18 SrDNA入与5.8SrDNA间的内转录间隔区1(internal-transcribed spacer-1,ITS-1)，5.8SrDNA与28SrDNA间的内转录间隔区2(internal-transcribed spacer-1，ITS-2)。一般编码区的序列较保守，而内转录间隔区（ITS）进化较大，在一个属内不同种间变异较大，对鉴定真菌菌种是有价值的。选择rDNA的ITS区域是当前进行种间分类和种系发生关系最可靠的编码区。

Makimura[5]根据ITS的序列分析建立了种系发生树，将毛癣菌属分为3群，并指出过去对皮肤癣菌的分类过细，而以种系发生关系的基因型划分与传统的分类方法有很大的区别，需要大量的进一步的研究来统一种系发生关系的基因型划分。然而，尽管测序可获得最准确最可靠的分类资料，但此技术对DNA的量和纯度要求较高，仪器设备价格昂贵，操作技术要求高，限制了它在医学真菌中的应用。

5 单链构象多态性（SSCP）分析

单链构象多态性是利用保守区的序列作为引物，以PCR进行扩增，将扩增的DNA片段变性，使其解链成为单链DNA，在一定条件下通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，DNA上微小的碱基差异即可形成不同的DNA构象，在凝胶上的迁移率亦不同，反映出单链DNA片段的多态性。

Kumar等从曲霉病、念珠菌病、角膜炎和皮肤指甲感染病人中分离得到的菌株，用PCR-SSCP对其rRNA的大亚基（LSU）和小亚基（SSU）进行放大和分析，由于使用了小亚基和大亚基特异引物，结果鉴定出各种菌属。这表明SSCP可以用来区别真菌到属的水平。

近年来，SSCP法对白念珠菌序列变异进行的检测结果表明，在DNA多个位点已能够检测到SSCPs，并且被序列测定结果证实。由于使用了基因位点特异的引物，故检测到的等位基因除可用于分类鉴定，还可通过测序了解各多态性的分子基础。此外，SSCP法还可用于真菌的基因分型等。

6 电泳核型（EK）分析

电泳核型是指细胞中的染色体在一定电场作用下，在固体包埋物中的排列情况，反映了染色体大小、数目和形状的差异。由于各分类水平上不同分类单位的染色体总会存在一定的差异，因此其EK必然呈现多态性。

EK分析的多态性明显，分辨率较高，电泳条件稳定时结果的重复性好。但有多种因素可影响实验结果，如电泳缓冲液的离子浓度、电泳温度、凝胶硬度、脉冲时间、电压等等。因此这一潜力很大的分类学方法尚有待于进一步从技术上进行完善和改进。

7 基因探针技术

基因探针技术结合了酶切图谱法和分子杂交法，原理是应用一段带有标记的特异性核苷酸序列，通过杂交检测与探针互补的DNA或RNA片段。基因探针技术与其他一些分子生物学技术（如PCR技术）结合，可以具有很高的敏感性。

黄媛等建立了PCR结合生物素标记的寡核苷酸探针斑点杂交技术鉴定临床常见真菌的方法，将9种临床常见致病真菌鉴定到种。Posteraro使用反向斑点杂交方法快速检测经PCR扩增的真菌DNA，其中念珠菌的种属特异性探针指向ERG11区域，这项技术比PCR-RFLP有较大提高，可对痕量核酸样品进行分析，同时基因探针的特异性使实验结果很少受到非特异性因素的影响，更适用于临床微生物检验。

8 基因芯片技术

DNA 芯片技术是用免疫荧光标记的待测样品与有规律地固定芯片片基上的大量探针按碱基配对原则进行杂交，通过激光共聚焦荧光系统对芯片进行扫描，用计算机进行荧光信号强度的比较和检测的技术。其突出特点在于高度并行性、多样性、微型化和自动化。将不同属种真菌的特异性DNA标记后制成DNA芯片，将致病真菌DNA与DNA芯片杂交就可得到属种特异性图谱，通过这种图谱的比较和分析，就可得出致病菌的DNA信息，进而可对其进行鉴定。

黄爱华以5.8srDNA与28srDNA间的内转录间隔区2为靶标，针对待检的临床常见致病真菌念珠菌属、曲霉属、皮肤癣菌等设计合成一系列寡核苷酸探针，制成寡核苷酸芯片。待检真菌DNA经通用引物扩增标记后，与芯片杂交，对杂交图谱分析归纳，得到一套种特异性的典型杂交图谱。结果表明，该研究建立的基因芯片技术可以有效地区分20种临床常见致病真菌，收集从临床分离的84株致病真菌菌株对基因芯片进行试用，结果显示基因芯片的鉴定结果与常规鉴定方法的鉴定结果不一致。结论为这项技术的建立可以稳定、特异性地实现临床常见致病真菌的高通量鉴定，为进一步检测研究奠定了基础。