宫艳格,刘德梦

(天津医科大学第二医院感染性疾病研究所,天津 300211)

尿道致病性大肠埃希菌是引起泌尿系统感染常见且重要的致病菌。黏附素在介导泌尿系统感染过程中发挥重要作用。在目前发现的大肠埃希菌多种黏附素中,Afa/Dra家族黏附素中的 Dra黏附素与30%～50%膀胱炎、青年女性复发性泌尿系统感染密切相关,携带Dra黏附素的大肠埃希菌有形成慢性和复发性感染的倾向[1,2]。2008年 7月～2009年7月,我们对大肠埃希菌Afa/Dra家族黏附素进行研究,为大肠埃希菌的生物学治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 尿道致病性大肠埃希菌及受体菌来源 收集我院近 1年反复发作性泌尿系统感染患者尿标本中分离出的大肠埃希菌 50株,经常规生化及血清学鉴定确定为尿道致病性大肠埃希菌。afa/draC基因阳性对照菌株AAEC191A(pCC90)由美国华盛顿大学 Steve Moseley教授惠赠,克隆受体菌 E.Coli DH5a由扬州大学畜禽病原微生物研究室朱国强教授惠赠。

1.1.2 PCR引物 afa-f:CGGCTTTTCTGCTG AACTGGCAGGC,afa-r:CCGTCAGCCCCCACGGCAG ACC[3]。引物序列由上海生物工程公司合成。

1.1.3 主要仪器及试剂 Mastercycler personal PCR仪(eppendorf公司),GELDOG-200型凝胶成像系统(美国B IO-RAD公司),Taq DNA聚合酶 (大连TaKaRa生物工程公司)。选择培养基为在LB固体培养基中加入氨苄青霉素 (终浓度 100 mg/ml)、5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷 (X-gal,终浓度 40 mg/ ml)、异丙基-β-D硫代半乳糖苷 (IPTG,终浓度 24 mg/ml)制成,PCR产物纯化试剂盒及 T(pUCm-T载体)-A克隆试剂盒(上海生物工程公司)。

1.2 方法

1.2.1 PCR扩增 ①煮沸法制备基因组 DNA。②PCR扩增:10×PCR buffer 2.5 ml,dNTP 250 mmol/ ml,afa-f 30 pmol/L,afa-r 30 pmol/L,Taq DNA聚合酶 0.025 U/ml,DNA模板 2 ml,去离子水 16.875 ml。PCR反应条件:预变性 94℃4 min,变性 94℃30 s,退火 53℃30 s,延伸 72℃1 min,共 30个循环,延伸 72℃8 min,4℃保存。③PCR产物分析: 1%琼脂糖凝胶电泳,如果出现明显的 672 bp亮带可能为阳性菌株。……