黄相艳,石 红

(大连医科大学 附属第一医院 妇产科，辽宁 大连 116011)

宫颈癌是妇产科常见的恶性肿瘤之一，HPV感染虽是其已知的主要致病因素，但由于HPV并不能单独致瘤，细胞内遗传性因素的改变可能具有更重要的意义。现代遗传学和分子生物学的研究均提示在宫颈上皮病变中存在人类染色体端粒酶基因(the human telomerase gene，hTERC)的扩增，鉴于已知端粒酶在肿瘤发生中的重要作用及其与端粒酶基因表达的一致性，人们推测，染色体端粒酶基因的扩增与宫颈病变的发生有密切联系。本文就相关研究进展进行简单综述。

1 染色体异常与宫颈癌变

分子生物学研究已经证实，肿瘤是基因病。各种环境的和遗传的致癌因素可能以协同或序贯的方式引起细胞内非致死性的DNA损害，这种错误的不断积累导致肿瘤的发生[1]。宫颈癌也是多种遗传事件不断积累的结果，只是不同肿瘤具有不同的异常染色体及染色体带，每种类型肿瘤的染色体改变具有特异性及一致性。子宫颈从不典型病变到浸润性癌常需要一段时间较长、阶段性较强的转化期，其阶段性进程特性更有利于人们从细胞自身遗传学角度研究其从CIN进展为宫颈癌的机制，为从染色体分子水平研究宫颈病变提供了可能。

针对宫颈癌染色体异常的研究发现，子宫颈癌变与1，3，4，5，6，11，13，17，18和20号染色体异常有关[2-4]。其中比较重要的是1号染色体和3号染色体，它们是主要的非随机事件。关于3号染色体，国外已有研究[5-7]，3号染色体长臂的扩增可能是浸润性宫颈癌的重要特点和宫颈癌发生发展过程中的早期事件。国内刘腾飞等[8]在建立子宫颈癌发展演进树模型的过程中也发现，3号染色体长臂扩增(+3q)在子宫颈癌非随机染色体事件统计中的发生频率可高达70.7%，且+3q的出现可能导致+17q的发生，而+17q的发生又将促进+20q的发生，+20q的发生必将增加+5p、+20p出现的概率。从距离树可以清楚地得出+3q是宫颈癌发生发展过程中较重要的早期事件。国内外这些针对子宫颈癌染色体的研究，均显示了3号染色体长臂的扩增可能是宫颈癌变发生发展过程中的重要事件和早期事件。这提示，在3号染色体长臂上可能存在与宫颈癌发生发展密切相关的肿瘤基因。此基因放大区域已经被确定为3q24-28。其中，所涉及最重要的基因可能是人类染色体端粒酶基因[5-7](即hTERC基因，位于3q26.13)，这为后续相关研究指明了方向。

2 HPV与端粒酶及端粒酶基因

目前的研究已经表明,高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染是宫颈癌发病的首要因素。据统计80%的妇女一生中都会有过一次HPV感染，但由于人体自身具有免疫力，多数HPV会被清除，说明单纯的HPV感染并不能致瘤，仍需要其他因素的参与[4]，这其中细胞内遗传性因素的改变可能具有更重要的意义。高危型HPV的持续感染，改变了宫颈上皮细胞的内外环境，引起细胞内非致死性的DNA损害，这种错误的不断积累导致宫颈上皮恶性转化的可能急剧上升，最终导致癌的发生。研究已经证实，HR-HPV在宫颈良性病变中以游离状态存在为主，癌变过程中，在某些细胞内外因素的触发作用下，DNA整合到宿主细胞，游离态HR-HPV数量减少，E2表达中断。当E2表达降低到一定程度时，失去对共同存在的整合形式的HR-HPV的抑制作用，癌基因E6/E7表达增加[9，10]，E6/E7的过表达则增加了整合的HR-HPV的选择优势和宿主染色体的不稳定性。在E6/E7的作用机制中，E7引起染色体异常复制，导致宿主染色体不稳定，使宿主细胞癌变，而E6能抑制抑癌基因p53介导的细胞凋亡，并激活端粒酶[11]。亦有研究指出，p53基因被抑制后发挥作用的同时会对端粒酶基因及端粒酶的激活产生协同作用，促进癌症的发生。这提示HPV的致癌过程也与端粒酶及端粒酶基因密切相关。Snijder[12]等研究认为HPV感染早于端粒酶基因水平上调，是端粒酶活化的原因。Aloysius[13]等也得出了同样的结果，并且发现HPV的作用十分迅速，在HPV的感染后的第一代细胞中就检测到端粒酶的活性。Hopman等[14]也通过应用FISH方法检测CINⅡ/Ⅲ、微浸润癌和浸润性宫颈癌的hTERC基因和HPV整合，发现在HPV整合的双倍体病变中，80%可见hTERC基因增加，且在hTERC基因增加的病例，HPV整合突出，提示了HPV整合与hTERC基因扩增的平行及一致性。结合以往研究，人们推测端粒酶基因及端粒酶的激活可能是HPV致癌机制中的重要环节，继发于HPV感染的宫颈上皮病变的发生仍需要端粒酶基因扩增的参与作为首要补充，且这种基因的改变先于恶性基因转变并伴随着从ASCUS至CINⅢ的进展[15]，是宫颈病变的早期事件。

3 端粒、端粒酶及端粒酶基因

可以看出，在针对宫颈癌的研究中，不管是染色体水平还是HPV致癌的分子水平均有端粒酶或端粒酶基因的指向，说明端粒酶及端粒酶基因与宫颈癌变进程有关，并可能在其中发挥了重要作用。端粒酶的意义是通过端粒的作用来实现的。端粒是真核生物染色体末端的特殊结构。端粒结构对于真核染色体DNA复制过程中保持DNA长度有非常重要的作用，如果没有端粒，染色体之间就会相互粘连，结构发生变化，并可能以其他方式表现出错误的行为，如降解、融合、重组和易位等，而这些错误能够严重地威胁染色体的生存和复制，可导致细胞死亡和错误复制[16]。由于DNA聚合酶不能完全复制染色体末端，因此，端粒的长度随着细胞分裂的不断进行而逐渐缩短，细胞趋向衰亡，被认为是细胞分裂的“生物钟”[17]。

端粒酶是影响端粒长度的主要因素。它是一种特殊的逆转录核糖核蛋白酶，能以其自身的RNA为模板，向端粒末端添加( TTAGGG)n序列，以保持端粒的长度和细胞的生存，从而延长细胞的寿命甚至使其“永生”[18]。已经有大量的研究显示端粒酶活性的上调与肿瘤的发生有关。端粒酶在恶性肿瘤中的阳性表达率达90%～100%，而正常人体细胞几乎未检出端粒酶的活性，现在的观点认为癌细胞正是由于端粒酶活性增强使染色体端粒维持在一定长度而获得了永生和无限增殖[19]。

人类端粒酶包括三个主要组成部分，人端粒酶RNA (human telomerase RNA component,hTERC)，人类端粒酶相关蛋白 1(human telomerase associated protein1,hTEP1)，人类端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)。其中hTERC为端粒酶的主体结构，含有编码端粒DNA的模板区、端粒酶蛋白结合区等。hTERC基因定位于3q26.3，是端粒酶延长端粒的模板，同时在介导端粒酶组装，活性调节等方面发挥着重要作用[20]。有研究表明，敲除编码小鼠端粒酶RNA基因，端粒酶活性丧失，说明了hTERC基因在端粒酶活性调控中的必要作用。

4 宫颈病变与hTERC基因

宫颈癌作为恶性肿瘤的一种，同样适用于由端粒酶基因调节的端粒酶活性上调、端粒维持、细胞永生化而导致恶性病变发生的机制。Olaharski[21]等用FISH方法研究宫颈巴氏涂片中的端粒酶基因表达情况，发现CINⅡ、CINⅢ中，端粒酶基因阳性表达者分别占63%和76%，均与正常组差异有统计学意义，且两者之间的差异也有统计学意义，指出端粒酶基因的阳性表达率和拷贝数随宫颈病变的严重程度而增加，且在这些病例随访1～3年后，在端粒酶基因阳性表达的病例中，可以观测到CINⅠ/Ⅱ进展到CINⅢ者占40.7%，提示这种基因组的扩增改变是子宫颈癌前病变发展到浸润癌的重要条件甚至必需因素。Heselmeyer-HK等[15]也发现CINⅡ及CINⅢ的端粒酶基因阳性表达率明显区别于正常样本、ASCUS及CINⅠ，其敏感性及特异性均能达到90%，且在从正常进展到CIN3及浸润癌的妇女中，有33%的病例发现了长臂的扩增。而对于CINⅠ/CINⅡ到CINⅢ的敏感性检测是100%，对于其退化的敏感性是70%。亦提示了端粒酶基因扩增是子宫颈癌变的早期事件，且是宫颈癌变进展的重要条件，通过对这种基因的检测可以帮助识别低级别损害进展的危险性并减低细胞学筛查的假阴性率。这些研究均提示端粒酶基因可能成为宫颈病变的一种新的生物学标记和独立的检测手段，可用于子宫颈癌的筛查及早期诊断，并能在一定程度上评估个体损害恶变的潜在危险性。

5 关于FISH技术

人们在针对宫颈病变的研究中发现了端粒酶基因在宫颈病变发生发展中的重要作用，提示端粒酶基因可能成为宫颈病变的一种独立的检测手段，并能在一定程度上评估个体损害恶变的潜在危险性。通过对携带基因扩增细胞的数量的统计分析使这种现象成为一种可应用的识别标志。

这种目标基因的显影就是通过应用原位杂交技术实现的。目前，应用比较广泛的原位杂交技术是荧光原位杂交技术(fluorescent in situ hybridization，FISH)。FISH是将细胞原位杂交技术和荧光技术有机结合而形成的新技术，其原理是基于碱基互补的原则，用荧光素标记的已知外源DNA或RNA作探针，与载玻片上的组织切片、细胞涂片、染色体制片等杂交，特异的探针与待测核酸的靶序列专一性结合，通过检测杂交位点的荧光信号来显示特定核苷酸序列的存在、数目和定位[22]，并通过对这些项目的评定来探讨或诊断疾病。

这一技术的优点是可以在保持细胞形态完整性的条件下，检测出细胞内特定核酸的序列。与宫颈液基薄层细胞学检查相比，它直接对机体细胞中最稳定的DNA结构进行检测，更能从本质上解释和诊断疾病，且这种方法采取了量化诊断方式，避免了主观偏差对诊断的影响，受主观因素影响极小，更客观可信。在技术上，FISH标本取材简单，可与细胞学同时取材，不增加患者的负担；可用于间期细胞,不需要细胞培养，操作相对简单，稳定性较好，可在早期发现少量病变细胞的遗传学异常，有利于对疾病的早期诊断和治疗，有利于降低子宫颈癌的发病率和死亡率。这为子宫颈癌的筛查及诊断提供了新的策略。

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