胡 意 ，郭 菲 ，娄远蕾 ，缪丽芳 ，陆 丹 ，汪 泱

(1、南昌大学第一附属医院检验科；2、烧伤研究所；3、泌外研究所；4、南昌大学研究生院，江西 南昌 330006)

由于细菌感染、烧伤或创伤等因素可引起脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)进入血液，激活单核细胞、巨噬细胞，促使其释放过量肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素类及NO等多种炎性介质，进而造成肝、肺、心脏、肾等组织和器官的损伤，导致多脏器功能不全综合征 (multiple organ dysfunction syndrome,MODS)[1]。而Ca2+作为第二信使，在LPS的活化过程中，具有重要的信号传导作用。Ca2+能够传递外界刺激的信号，启动基因转录，促使细胞分泌大量的炎性细胞因子[2]。本课题小组前期研究表明镧具有结合LPS降低内毒素毒性的作用，减轻内毒素对机体造成的损伤[3,4]，且一定浓度氯化镧(LaCl3)可显著抑制LPS诱导小鼠巨噬细胞产生NO[5]。随着对稀土化合物生物效应研究的深入，稀土化合物发挥生物效应的分子机制已成为学者日益关注的课题。本研究探讨LaCl3对LPS诱导巨噬细胞钙信号通路激活及其释放TNF-α的影响。

材料与方法

1 材料 氯化镧(LaCl3·7H2O，纯度99.9%，Sigma，美 国 )、LPS (Ecoli.serotype O55B5；Sigma， 美 国 )、DMEM/F12 液体培养基 (LPS＜0.03μmol/ml，Hyclon，美国) 和胎牛血清(LPS＜0.03μmol/ml，Gibco，美国)、流式细胞仪 (Becton Dickinson， 美国)、CO2培养箱(Forma， 美国)、TNF-α ELISA 试剂盒 (Diaclone，法国)，Fluo-3/AM(Molecular Probes，美国)。

2方法

2.1 器材的准备、灭菌、去热原处理 所用玻璃器具均经硫酸清洁液浸泡，充分洗涤后于250℃干热消毒4h。所用塑料制品清洗干净后用30%双氧水浸泡4h，用三蒸水冲洗后于60℃烘干，再于120℃高压灭菌。

2.2 细胞培养及处理 RAW 264.7细胞购自中科院上海细胞生物研究所。以1×106接种于去热原培养瓶，以含5%胎牛血清的DME/F12液体培养基于5%CO2孵箱37℃培养。取生长状态良好的细胞随机分成四组。LPS组：培养液中含1μg/m l的LPS；LaCl3+LPS组：以含2.5μmol/ml LaCl3的培养基培养一定时间后，更换为含1μg/ml LPS的培养基继续培养；LaCl3组：培养基中含 2.5μmol/ml的 LaCl3；对照组：培养基中不含LaCl3和LPS。按照各指标要求与不同时间点收集细胞培养上清和细胞待测。

2.2 .1 流式细胞术测[Ca2+]i参考文献[6-8，9]，取对数生长其细胞，以KRH液(130mmol/L NaCl，1.3mmol/L KCl，2.2mmol/L CaCl2，1.2mmol/L MgSO4，1.2mmol/L，KH2PO4，10mmol/L HEPES,10mmol/L 葡萄糖,pH 7.4)漂洗细胞三遍，随后以荧光染料负载细胞(5μmol/L Fluo-3/AM于25℃孵育细胞30min)，为促进Fluo-3溶解和细胞内负载，同时加入20%的pluronic F-127促进Fluo-3进入细胞。负载结束后KRH液洗去多余荧光染料。 实验分组同前，各组培养时间如下：LPS组 (LPS 1μg/ml的培养基培养2min)、 LaCl3+LPS(LaCl32.5μmol/ml的培养基培养50s后更换含LPS 1μg/ml的培养基继续培养2min)、LaCl3组(LaCl32.5μmol/ml培养50s)。取各组细胞于流式细胞仪检测，参数设置为激发光波长488nm，发射波长526nm。按照公式计算[Ca2+]i：[Ca2+]i=Kd[(F–Fmin)/(Fmax–F)]，其中Kd为Fluo-3的解离常数(400nM)，F表示细胞的荧光强度，Fmin和Fmax分别为最小和最大荧光强度。Fmin是加入EGTA(终浓度3mmol/L，pH＞8.5)后测得的最小荧光值；Fmax则是加入10μmol/L A23187 Ca2+载体并使胞内Ca2+饱和后测得。上述实验重复三次。

2.2 .2 ELISA方法检测 TNF-α含量 除LaCl3+LPS组(先用LaCl3培养24h再用LPS培养24h后收集培养上清)，其余各组细胞分别培养24h后取各组细胞培养上清。采用ELISA方法检测TNF-α含量(具体操作按其试剂盒说明书进行)，实验重复三次。

2.3 统计学处理 实验数据以均数±标准差 (x±s)表示，采用SPSS 12.0统计软件对实验结果进单因素方差分析，P＜0.05为有统计学意义。

结 果

1氯化镧对LPS激活巨噬细胞钙信号通路的影响

流式细胞术测定结果显示LPS组 [Ca2+]i为(336.67±26.16 nmol/L)与空白对照组 (32.33±5.51 nmol/L)比较，差异显著(P＜0.01)；LaCl3+LPS 组[Ca2+]i为(162.67±26.41nmol/L)显著低于LPS组及空白组(P＜0.01)；LaCl3组为(29.84±6.42nmol/L)显著低于 LPS组(P＜0.01)，与对照组相比略低但没有显著差异(P＞0.05)，由此可见氯化镧可降低细胞内Ca2+浓度 (表1)。

表1 各组RAW264.7细胞TNF-α含量及[Ca2+]i变化比较s)

表1 各组RAW264.7细胞TNF-α含量及[Ca2+]i变化比较s)

*P＜0.01 vs.LPS 组；#P＜0.01，##P＜0.05 vs.对照组

336.67±26.16#162.67±26.41#29.84±6.42*32.33±5.51组别 TNF-α含量(pg/m l) [Ca2+]i(nmol/L)LPS组LaCl3+LPS组LaCl3组对照组152.19±15.68#43.95±6.55*27.84±3.73*##40.85±4.02

2氯化镧对LPS激活巨噬细胞释放TNF-α的影响

LPS组细胞培养上清中TNF-α含量为(152.19±15.68pg/ml)与空白对照组(40.85±4.02pg/ml)相比，显著升高(P＜0.01)，说明LPS能刺激TNF-α的释放，而LaCl3+LPS组细胞培养上清中TNF-α含量为(43.95±6.55pg/ml)，与 LPS 组相比，显著下降(P＜0.01)且与对照组相比没有差异，LaCl3组细胞培养上清中TNF-α含量(27.84±3.73pg/ml)与LPS组相比显著下调(P＜0.01)并且与对照组相比有差异(P＜0.05)，表明氯化镧能抑制LPS诱导TNF-α的释放(表1)。

讨 论

巨噬细胞是LPS侵入机体作用的主要靶细胞之一，广泛分布于全身各个组织和器官,可分泌多种生物活性物质调节细胞功能、参与免疫应答。不少研究表明增加细胞内钙离子浓度增加LPS引起的感染性休克的死亡率。LPS可导致细胞内 [Ca2+]i升高，增加[Ca2+]i会促进LPS引起的内毒素血症[10]，而使用Ca2+拮抗剂对内毒素性休克具有保护作用[11]。有实验证实镧系元素钆可以部分阻断大鼠椎间盘纤维环细胞内的Ca2+通道[12]。稀土离子半径(0.096～0.115nm)与 Ca2+的半径(0.1nm)非常接近，在生物体中通常与Ca2+结合在相同位置上，且稀土离子比Ca2+多一个正电荷，因此可以作为Ca2+在细胞和亚细胞水平发挥作用的拮抗剂[13]。课题小组曾对镧拮抗内毒素的体内效应进行了探讨，结果表明LaCl3能结合LPS降低内毒素的毒性。本实验则采用特异性Ca2+荧光指示剂Fluo-3/AM负载细胞，与Ca2+结合的Fluo-3在波长488nm处激发,发射波长为526nm(绿色)，流式细胞仪测定其荧光强度并计算游离 [Ca2+]i，以探讨镧抑制内毒素效应的可能机制。实验结果显示，LPS攻击后巨噬细胞内游离[Ca2+]i明显升高，而一定剂量LaCl3处理后的细胞内游离[Ca2+]i明显低于LPS组，表明LaCl3抑制了LPS诱导巨噬细胞内游离[Ca2+]i的升高。

TNF-α是LPS激活单核/巨噬细胞所释放的一种多肽类细胞因子，由于其发挥活性作用表现为对LPS的依赖或协同作用，故被公认为是引起内毒素休克、MODS及炎症反应的重要起始因子[14]。因此，降低TNF-α的水平是降低感染性休克死亡率的关键之一。我们通过本实验发现LPS可明促进巨噬细胞TNF-α的分泌，而LaCl3可显著抑制LPS诱导TNF-α的释放。由此，笔者结合课题小组前期工作[15]分析LaCl3除可能直接结合LPS，抑制LPS的活性外，还可能作为Ca2+拮抗剂影响细胞内Ca2+流通，从而影响LPS对巨噬细胞的激活效应，减轻LPS对机体的损伤。

[1]杨文修,李晓东,刘保华,等.大黄抑制脂多糖刺激巨噬细胞升高[Ca2+]i和释放TNFα的特征[J].南开大学学报(自然科学版),2003,36(03):111-1115.

[2]Brown DM,Hutchison L,Donaldson K,et al.The effects of PM10 particles and oxidative stress on macrophages and lung epithelial cells:modulating effects of calcium-signaling antagonists[J].Am J Physiol,2007,292(6):1444-1451.

[3]汪 泱,袁 铿,曹 勇,等.氯化镧拮抗内毒素作用的初步研究[J].中国稀土学报,2002,20(2):190-192.

[4]汪 泱,胡 峰,郭 菲,等.氯化镧拮抗内毒素效应的小鼠体内研究[J].中华医学杂志,2004,84(3):242-247.

[5]娄远蕾,郭 菲,汪 泱,等.稀土化合物氯化镧对脂多糖诱导小鼠巨噬细胞分泌-氧化氮的影响[J].实验与检验医学,2008,26(3):221-223.

[6]Kao JP,Harootunian A T,Tsien R Y.Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3[J].JBiol Chem,1989,264(14):8179-8184.

[7]Zhu Y,Gu Z L,Liang ZQ,et al.Prostaglandin A1 inhibits increases in intracellular calcium concentration,TXA(2)production and platelet activation[J].Acta Pharmacol Sin,2006,27(5):549-554.

[8]Sudhandiran G,Shaha C.Antimonial-induced increase in intracellular Ca2+through non-selective cation channels in the host and the parasite is responsible for apoptosis of intracellular Leishmania donovani amastigotes[J].JBiol Chem,2003,278(27):25120-2532.

[9]Mueller,LP,Yoza BK,Neuhaus K,et al.Endotoxin-adapted septic shock leukocytes selectively alter production of sil-1RA and IL-1[beta[J].Shock:Basic Science Studies,2001,16(6):430-437.

[10]Hassoun SM,Marechal X,Montaigne D,et al.Prevention of endotoxin-induced sarcoplasmic reticulum calcium leak improvesmitochondrial and myocardial dysfunction[J].Crit Care Med,2008,36(9):2590-2596.

[11]谢文利,赵 珊,林秀珍,等.大承气汤对内毒素休克家兔白细胞内游离钙浓度的影响[J].天津医科大学学报,1999,5(3):3-4.

[12]郭志良,周 跃,成 敏,等.周期性张应变对椎间盘纤维环细胞内游离钙离子浓度的影响[J].第三军医大学学报,2006,28(11):1212-1214.

[13]Lansman JB.Blockade of current through single calcium channels by trivalent lanthanide cations.Effect of ionic radius on the rates of ion entry and exit[J].JGen Physiol,1990,95(4):679-696.

[14]Mannel,DnB Echtenacher,TNF in the inflammatory response[J].Chem Immunol,2000,74:141-161.

[15]Wang Y,Hu F,Guo F,et al.Anti-endotoxin effect of lanthanum chloride in vivo:an experimental study ofmice[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2004,84(3):242-247.