潘长福 ，阮琼芳 ，沈晓黎 ，涂 伟 ，娄远蕾 ，匡助才 ，赖贤良 ，汪 泱 ，邓志锋*

(1、南昌大学第二附属医院神经外科；2、南昌大学泌尿外科研究所；3、南昌大学研究生院医学部，江西 南昌 30006)

脑外伤是一种常见的致死、致残性疾病，随着现代交通工具的发展，其发病率呈现逐年上升的趋势。人类海马区神经元与学习记忆紧密相关，但该区神经元对脑外伤极为敏感，伤后神经元大量变性坏死，导致患者学习记忆功能障碍[1]。近年来研究发现，成年哺乳动物海马齿状回亚颗粒区(subgranular zone，SGZ)存在神经干细胞(neural stem cells，NSCs)，这些细胞在脑外伤后被激活，增殖分化成功能上成熟的神经元，整合到神经网络中，一定程度上能促进患者神经功能的恢复[1]。但是脑外伤后NSCs增殖分化能力十分有限，远不能达到临床恢复的要求。因此，如何最大程度地提高神经干细胞增殖分化能力是治疗脑外伤的关键。近年来研究证实，notch信号表达在成体海马区神经干细胞中，在其增殖分化调控机制中起着极其重要的作用[2]。然而notch信号是否也调控脑外伤后神经干细胞增殖、分化过程，目前并不清楚。本研究拟通过自由落体法复制闭合性脑外伤小鼠模型，从基因水平上观察脑外伤后海马区notch信号的表达变化，初步探讨该信号与内源性神经干细胞增殖、分化的关系，为以后进一步深入研究notch信号调控成体神经再生机制提供理论基础。

材料与方法

1 实验动物分组及模型制备 Balb/c系雄性小鼠，体重23g左右，购自南昌大学医学院动物实验中心。随机分为假手术(sham)组、脑外伤4h、1d、3d模型组，每组分别3只动物。参考文献，采用改良的自由落体法复制闭合性脑外伤小鼠模型[3]。打击装置由脑立体定向仪、垂直导管、下落砝码、顶端涂有聚乙烯的撞针组成，撞针底端直径3mm(安徽淮北正华生物仪器设备有限公司提供)。异氟烷吸入麻醉小鼠后，将头部固定于脑立体定向仪上，消毒，沿中线切开头皮，暴露头盖骨，分离骨膜，将撞针置于前、后囟门中点偏左1mm。以40g砝码从25cm高处沿垂直导管自由下落，撞击撞针造成脑损伤，缝合头皮，给以充足水和食物喂养。假手术对照组仅切开头皮，暴露颅骨，不实施打击。伤后1h根据NSS评分系统(表1)评分[4]，筛选7～8分重度脑外伤小鼠纳入实验研究对象。

表1 小鼠脑损伤NSS评分系统

2 组织标本制备 脑外伤组分别在伤后4h、1d、3d处死动物，显微镜下迅速分离伤侧海马组织，-80℃保存，以备提取总RNA。

3总RNA抽提 收集组织标本，按Trizol试剂说明书提取总RNA。所提总RNA行紫外分光光度计检测A260/A280在1.8～2.0之间，并计算浓度，-80℃保存备用。

4实时定量RT-PCR (real-time PCR)检测notch1、hes1mRNA 表达 取 1μg总 RNA，使用 Fermentas逆转录试剂盒，随机引物逆转录合成cDNA。按以下体系进行Real-time PCR反应：cDNA模板1μl，2×PCR mix 10μl，2μmol/L 上下游引物各 1μl，0.5μL 10×SYBR GreenI，加无菌水至 20μl，不加模板为阴性对照。将反应管置于ABI 7500 real-time PCR system中进行扩增反应。反应条件如下：95℃，10min；95℃ ，15sec，60℃ 30sec 72℃ 30s for 40cycles；72℃10min。以GAPDH为内参，假手术组海马组织为对照组，用2-ΔΔCt值表示基因的相对表达量。Notch1 上 游 引 物 ：5＇-CCTTGGGTTCATGGATTAGTTTTG-3＇， 下 游 引 物 ：5＇-CTCAGTTGGATTTGGATGATGCT-3＇。 Hes1 上 游 引 物 ：5＇-TACCCCAGCCAGTGTCAACAC-3＇， 下游引物：5＇-TTTCCAGAATGTCTGCCTTCTCTA-3＇。

5统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。所得数据均以±s表示，进行单因素方差分析。P＜0.05为有统计学意义。

结 果

脑外伤后伤侧海马notch1和hes1 mRNA的表达变化

Real-time PCR结果显示，脑外伤后notch1基因在伤后4h即开始升高，1d时达到高峰，较对照组升高约6倍，3d时有所回落，但仍维持在高水平，较对照组升高2倍；而hes1基因在伤后4h表达无明显变化，1d时明显升高，较对照组升高3倍，3d时则回落到正常水平，如图1所示。

图1 脑外伤后motch1、hes1 mRNA的表达

讨 论

人类海马区神经元与学习记忆紧密相关，但该区神经元对脑外伤极为敏感，伤后大量神经元变性坏死，导致患者学习记忆功能障碍，可作为评价脑损伤严重程度的重要指标之一[1]。目前研究证实，成体哺乳动物海马齿状回亚颗粒区存在内源性神经干细胞，后者是一类能自我更新，具有分化成神经元、神经胶质细胞和少突胶质细胞能力的细胞群。这些细胞在脑外伤后被激活，增殖分化成功能上成熟的神经元，并整合到海马回路中，促进患者学习记忆功能改善[1]。

Notch信号通路为调控细胞命运的基本通路[5]。在脑的发育过程中，notch信号在神经干细胞增殖、分化过程中起着极为关键的作用[6,7]。激活notch信号，可维持神经干细胞的未分化状态[7,8]，促进其自我增殖[9]。最近研究表明，notch信号也在成年哺乳动物海马区和室下区表达，在成体神经再生过程中发挥着类似的调控作用[2]。Notch1为一种跨膜受体，当其与邻近细胞上的配体结合时，notch信号被激活，在γ-分泌酶的作用下，notch1释放出notch胞内区域段(Notch intracellular domain，NICD)，后者转移至胞核内，与DNA结合蛋白RBP-J/CSL结合，激活下游转录抑制因子hes1，从而发挥notch1介导的调控作用[10]。

本研究结果发现，脑外伤后海马区notch1 mRNA在伤后早期即开始升高，3d时仍维持在较高水平，hes1mRNA也在伤后早期升高1d，提示脑外伤可激活notch信号。而Sun、Urrea等[11-12]研究表明，脑外伤后海马齿状回内神经干细胞增殖在伤后早期即开始增殖，于2～3d时达到高峰，与伤后notch信号表达呈现时间上相一致的表达趋势。由此可以推测，脑外伤后notch信号表达水平的升高可能与神经干细胞增殖分化相关。因此进一步全面深入研究notch信号调控脑外伤后成体神经干细胞增殖、分化机制，可为将来临床治疗提供新的可能靶点,具有十分重要的意义。

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