李丽贤 综述 林昶 赵立东 杨仕明 审校

最近研究认为，Notch信号途径调节的侧抑制参与哺乳动物内耳感觉前体细胞定向分化为毛细胞和支持细胞的过程及其嵌合体的形成[1]，在该信号途径中，使用γ-分泌酶抑制剂后，Notch信号途径中级联反应效应被抑制，其下游转录因子Hes1和Hes5的表达减少，间接增加了Math1的表达，因而可能促进内耳毛细胞的发育。本文就Notch信号途径参与毛细胞发育的调控机制作一综述，以期对耳蜗毛细胞再生机理有更深认识。

1 Notch信号途径

Notch信号途径在进化上高度保守，广泛存在于果蝇、无脊椎动物和脊椎动物中，对细胞的分化、增殖和凋亡及机体的整个生长发育过程的调控等起着重要的作用[2]。随着对内耳感觉上皮发育分子机制研究的深入，目前认为Notch信号途径相关基因(Hes1和Hes5)在哺乳动物内耳感觉上皮发育中可能具有重要的作用。

1.1Notch信号途经的组成 Notch信号途经是由Notch受体、配体(DSL蛋白/哺乳动物是Jagged蛋白)和CSL(一类DNA结合蛋白)等组成。Notch配体N端有一个结合Notch受体所必需的DSL基序。当配体(如Delta)和相邻细胞的Notch受体结合后，Notch受体被蛋白酶体切割，释放出具有核定位信号的胞质区ICN(intracellular domain of Notch)，进入细胞核与CSL结合，调节基因表达。CSL为转录因子，在哺乳动物中名为CBF1，在果蝇中名为suppressor of hairless，在线虫中名为Lag-1，简称为CSL。CSL能识别并结合特定的DNA序列(GTGGGAA)，这个序列位于Notch诱导基因的启动子上，ICN不存在时，CSL为转录抑制因子，当结合ICN时，CSL能诱导相关基因的表达。Notch信号的靶基因多为碱性螺旋-环-螺旋类转录因子(basic helix-loop-helix，bHLH)，它们又调节其它与细胞分化直接相关的基因的转录。如哺乳动物中的HES(hairy/ enhancer of split)、果蝇中的E(spl)(enhancer of split)及非洲爪蟾中的XHey-1等。

1.2Notch信号途径的激活 Notch信号转导不需第二信使和蛋白激酶的参与，可直接接收邻近细胞的信号并传到细胞核，激活相关转录因子的表达。现有研究认为，Notch信号途径的活化主要采用“三步蛋白质水解模式”，其中涉及到3个蛋白质水解切割位点S1、S2和S3。全长新合成的Notch前体是胞内非活化分子，需被蛋白质水解切割后才具有活性。步骤如下：①分泌运输中，Notch前体首先被高尔基体内的Furin蛋白酶进行S1位点切割，形成的两部分通过钙依赖性非共价键结合形成的异二聚体, 成熟的Notch受体被运输到细胞表面[3]。②配体结合到Notch胞外区后，ADAM金属蛋白酶家族的TACE/Kuz在受体的S2位点切割，释放出胞外部分，留下膜黏连的胞内部分( Notch—intraTM)。③在跨膜区S3位点被早老素( presenilin，PS) 依赖的γ-分泌酶进行切割释放可溶的Notch胞内片段( Notch—intra)[4]。可溶的Notch-intra被转移至核内，与Su(H)CBF1(Suppressor of Hairless/C-promoter Binding Factor 1)结合，激活E(sp1)/HES(Enhancer of split/human En — hancer of Split)等靶基因的表达，E(sp1)/HES等表达产物与其相应的分化效应基因的启动子特异性结合，阻遏相关基因的表达，从而影响毛细胞的分化。参与调控Notch信号途径的基因均从胚胎早期就开始表达，在胚胎发育中起重要作用。

1.3Notch信号传导途径与内耳感觉上皮的分化 Notch信号途径在很多不同的物种、不同组织的发育、细胞的分化过程具有重要的调节作用。近年来的研究表明，Notch信号传导途径与哺乳动物内耳感觉前体细胞定向分化形成毛细胞和支持细胞及嵌合体的调节有关[1]。

1.3.1哺乳动物内耳感觉上皮的发育 哺乳动物内耳Corti器主要有两种细胞，即内、外毛细胞和支持细胞。毛细胞与毛细胞之间各自由支持细胞分隔开来，形成了独特的嵌合体形式，毛细胞由底回至顶回、内毛细胞至外毛细胞的顺序逐渐发育成熟。目前证实[1]Notch信号通过调节侧抑制(lateral inhibition)，即细胞表面Notch配体与相邻细胞膜上的受体结合，启动信号途径，防止其它细胞发生同样的分化，这种调节在内耳细胞定向分化及嵌合体形成中起关键作用。当毛细胞损伤后，Notch信号通路的侧抑制可能就削弱了，所以，有关支持细胞能转分化为毛细胞的学说也许和侧抑制的削弱有关，此待进一步研究。在耳蜗发育过程中Notch配体的表达在math1表达后才开始表达，并在Notch信号途径的侧抑制中发挥着作用。Notch受体和配体Dll1(Delta-like1)和Jag2(Jagged2)在E14.5就开始在内耳表达。而另一种配体Dll3(Delta-like3)在E15.5听觉毛细胞发育阶段与Dll1和Jag2共同表达且一直持续到出生一周后其表达才下调。实验还发现，Dll3缺陷的小鼠并不会导致毛细胞数量的增多[5]，而Notch配体Jag2或Dll1两者同时缺失时毛细胞数量出现大量的增多[6]；但当Jag2和Dll1单独缺失时，毛细胞数量变化并不大[6,7]，由此推测两者具有协同作用。这些实验结果表明Dll3存在与否并不影响毛细胞数量的变化，只要Dll1或Jag2其中一者存在就能发挥Notch介导的侧抑制作用，Dll1或Jag2对Dll3具有补偿作用。另有实验证明Notch的另一配体Jag1，其基因的表达或敲除并不影响Notch信号介导的侧抑制作用[8]。

1.3.2Notch信号下游效应基因Hes1、Hes5与前神经元基因math1对内耳感觉上皮分化的影响 在哺乳动物内耳感觉上皮中，Notch信号相关的靶基因家族主要是含有碱性螺旋-环-螺旋类转录因子bHLH基序的基因，在哺乳动物内耳感觉上皮的定向分化，特别在毛细胞的形成中起关键作用，并参与侧抑制的调控及嵌合体的形成，其中主要有Math1、Hes1、Hes5基因。 Math1是一个特定神经碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子，同果蝇的前神经元基因atonal(ato)具有较高的同源性。1999年Bermingham等[9]首次报道Math1基因在内耳感觉上皮中表达,Math1基因缺陷小鼠胚胎不能产生耳蜗和前庭毛细胞，Math1过表达能使耳蜗的GER(大上皮嵴)细胞及椭圆囊的支持细胞转化为额外的毛细胞[10]。在耳蜗发育阶段，Math1最早表达于E12.5,而在E14和P0期间是毛细胞开始分化的重要阶段，Math1首先表达，而后Hes1、Hes5才表达。Math1基因作为一种促毛细胞基因(pro-hair cell gene)在感觉细胞定向分化及毛细胞的形成中起关键作用[11]。Akazawa等[12，13]研究发现bHLH编码的math1蛋白中间的E-box相关的转录通过bHLH的另一种蛋白E 47，而Hes1和Hes5可以和E47形成没有功能的异二聚体来抑制E47的转录，进一步抑制Math1的作用。在ICR小鼠Jagged2基因突变体(Jag2△DSL)模型中发现了Hes5基因表达下降，因此，Notch可能通过Jag2激活Hes5基因表达，阻碍分化效应基因Math1的表达[14]。Hes1和Hes5是Notch信号途径下游效应因子，参与了耳蜗的发育和调节毛细胞的分化[15]。在Hesl和Hes5基因突变的小鼠耳蜗中Math1的表达增加，提示Hes基因通过抑制Math1的表达来调节毛细胞的分化。Math1可以直接与Hes5结合，激活Hes5反过来抑制Math1自身的表达，这是Math1表达负性自身调节环路[16]。实验显示Hes1过表达阻止Math1诱导的毛细胞分化,因此Hes1通过Math1对毛细胞分化产生负调节作用,这些结果提示Math1和负调节因子Hes1之间的平衡对于产生合适的内耳毛细胞数目非常关键[17]。在耳蜗，Hes1基因突变后可引起内毛细胞数量增加，而Hes5突变可引起外毛细胞数量增加；在前庭器官，无论是Hes1还是Hes5缺失都会引起椭圆囊或球囊产生额外的毛细胞。这就说明了Hes1和Hes5在调节哺乳动物内耳毛细胞的分化作用上既独立又有叠加[15]。

2 γ-分泌酶抑制剂促进内耳毛细胞再生

2.1γ-分泌酶的作用 γ-分泌酶在Notch受体的剪切并释放可溶的Notch胞内片段中起着关键的作用。有研究表明[18]，细胞表面的γ-分泌酶的蛋白水解作用是在细胞膜进行的，可以裂解细胞间的粘附结构并能释放胞间的信号片段。因此，使用γ-分泌酶抑制剂后可以阻止Notch信号的活化，进一步抑制了Hes1和Hes5的表达，从而以使Math1的表达增加[19]，这对内耳毛细胞的再生和修复可能起到重要的促进作用。

2.2γ-分泌酶抑制剂在体外培养Corti器的研究 近年来的研究表明，在体外培养胚胎期或新生的小鼠[20，21]Corti器中加入γ-分泌酶抑制剂(MDL28170或DAPT)阻断Notch信号通路后，能够使耳蜗产生额外的毛细胞。Yamamoto等[21]为了证明 Notch信号通路在耳蜗的作用，分别在体外培养的胚胎时期和新生(P3)的ICR小鼠Corti器里加入γ-分泌酶抑制剂MDL28170三天后，在毛细胞旁边的区域即Hensen细胞的位置出现了异位的MyosinVIIa阳性的细胞，且异位的MyosinVIIa阳性的细胞数比对照组明显的增多。RT-PCR分析显示：在MDL28170组Hes1和Hes5表达都有减少，其中Hes5减少明显，而Math1表达则增加。Takebayashi等[20]用另一种γ-分泌酶抑制剂DAPT对小鼠胚胎的Corti器进行研究，发现在E14.5时及其以后的胚胎期，DAPT才对Notch信号通路有抑制作用。RT-PCR检测显示Hes1和Hes5的表达减少，而Math1的表达增加，并且发现，毛细胞数目的增多不是因为毛细胞的增殖引起的，而是通过支持细胞转分化来的。

2.3γ-分泌酶抑制剂在体的实验研究 2007年Hori等[22]发现正常成年豚鼠听觉上皮几乎不表达Notch1和Jagged1，而用耳毒性药物造模后，发现损伤的听觉上皮可以表达Notch1和Jagged1。从鼓阶用微注泵持续给MDL28170，2周后可在听觉上皮出现异位myosinVIIa阳性的细胞，表明γ-分泌酶抑制剂阻断Notch信号后，在成年哺乳动物听觉上皮出现了异位的毛细胞，说明使用γ-分泌酶抑制剂阻断Notch信号通路对损伤的听觉上皮的毛细胞再生可能有促进作用。Notch1、Jagged1的表达和异位毛细胞的免疫表型主要在听觉上皮的内沟区，而胚胎和新生哺乳动物的听觉上皮的大上皮嵴区和成熟动物的听觉上皮内沟区域相对应[23]。

然而，体外培养和在体实验中发现γ-分泌酶抑制剂阻断Notch信号通路后，也会造成不良的副作用。Daudet等[24]研究发现在鸡胚的HH16-17时期就开始持续用DAPT抑制Notch信号，可能会导致听觉斑的数量、大小及毛细胞的减少。但是，相对于用病毒等载体携带Math1基因促进毛细胞再生的研究来说，γ-分泌酸抑制剂可不用考虑病毒的毒性，有利于临床的推广应用。所以，对于γ-分泌酶抑制剂，还需对其进行更充分的实验研究，以便能应用于内耳毛细胞再生的研究中。

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