董 翠,阴志刚,王纯耀#,张旭东

1)郑州大学生物工程系郑州 450001 2)郑州大学实验动物中心郑州 450052 3)郑州大学第一附属医院肿瘤科郑州 450052

#通讯作者,男,1962年11月生,教授,研究方向:分子生物学,E-mail:chunyao@zzu.edu.cn

端粒是真核细胞染色体末端的重复DNA序列,其生物学功能是防止染色体 DNA降解、末端融合、非正常重组和染色体的缺失[1]。端粒由端粒酶合成。人端粒酶主要由2部分组成,即端粒酶RNA模板和端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)[2]。端粒酶是肿瘤细胞特异的蛋白酶,90%以上的肿瘤细胞有端粒酶活性,而绝大多数正常细胞则检测不到或活性极低[3]。hTERT的转录水平和肿瘤的端粒酶活性密切相关,因此hTERT的启动子有可能成为一个靶向肿瘤的特异性启动子[4]。根据这一特点,作者克隆了hTERT的启动子,将其构建到真核荧光表达载体pEGFP-C3上,取代其原有的巨细胞病毒(CMV)启动子,并检测其功能,为后续的肿瘤靶向性治疗奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料 基因组DNA小量抽提试剂盒、质粒DNA小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒和PCR清洁试剂盒为爱思进生物技术(杭州)有限公司产品,T4连接酶和限制性内切酶为TaKaRa公司产品,LA Taq DNA聚合酶和pGEM-TEasy载体为Promega公司产品,DMEM细胞培养粉为Gibco公司产品,胎牛血清购于杭州四季青公司,脂质体LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司。真核荧光表达载体pEGFP-C3为郑州大学实验动物中心与韩志强教授合作实验室保种,其原有多克隆序列已通过 BglⅡ和HpaⅠ双酶切去除。大肠杆菌E.coli Top10和DH5α及人胚肾 293A细胞由郑州大学韩志强教授惠赠。

1.2 hTERTp引物的设计及合成 根据GenBank所提供的hTERT基因的序列设计引物,上游引物5'-ATTCGCGGGCACAGACGCCCAGGACCGCGC-3',下游引物5'-CGCGGGGGTGGCCGGGGCCAGGGCT TCCCA-3',扩增产物大小为276 bp。引物不含酶切位点,在表达载体pEGFP-C3上引入AseⅠ、SpeⅠ、NotⅠ、NdeⅠ、NruⅠ和AgeⅠ酶切位点。引物和多克隆位点由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 hTERTp的PCR扩增 使用基因组DNA小量抽提试剂盒,按照操作说明从 293A细胞中提取人基因组DNA,以人基因组DNA为模板,PCR扩增hTERTp。反应体系:2×GC Buffer 25μL,dNTPmix 6μL,人基因组DNA 3μL,上、下游引物各1μL,LA Taq酶0.5μL,ddH2O 13.5μL。反应条件:95℃预变性5min;95℃30 s,62℃30 s,72℃1 min,30个循环;72℃延伸6 min。10 g/L的琼脂糖凝胶鉴定克隆产物为所需目的基因后,使用DNA胶回收试剂盒回收hTERTp。

1.4 目的基因与 T载体的连接、转化及鉴定 胶回收的hTERTp用10 g/L的琼脂糖凝胶定量,然后与pGEM-T Easy载体连接,连接体系转化感受态E.coli Top10,在氨苄青霉素阳性LB平板上经蓝白斑筛选。重组质粒经PCR和NotⅠ单酶切鉴定,并送上海生工生物工程有限公司测序。

1.5 重组载体pEGFP-C3的构建及鉴定 用AseⅠ和AgeⅠ双酶切质粒pEGFP-C3,去除载体原来的CMV启动子,10 g/L的琼脂糖凝胶鉴定后回收目的片段。将合成的多克隆位点两链退火,连接到 pEGFP-C3去除CMV启动子的胶回收片段上,连接体系转化感受态E.coliDH5α,并接种于卡那霉素阳性平板上。重组pEGFP-C3质粒分别经NotⅠ、NdeⅠ酶切鉴定。

1.6 pEGFP-C3-hTERTp载体的构建及鉴定NotⅠ酶切重组真核表达载体pEGFP-C3和pGEM-hTERTp,胶回收hTERTp和pEGFP-C3双黏片段。将hTERTp与去磷酸化载体pEGFP-C3用T4连接酶连接,转化感受态E.coli DH5α,并接种于卡那霉素阳性LB平板上。重组载体经PCR鉴定,并集菌送测序。

1.7 重组表达载体pEGFP-C3-hTERTp转染293A细胞 转染前 1 d,取对数期生长的 293A细胞接种到 6孔板,使转染当天细胞汇合度达到90%～95%。用脂质体LipofectamineTM2000介导质粒转染,设pEGFP-C3转染组为阳性对照,按试剂说明操作。转染 48～72 h后在荧光显微镜下观察荧光表达情况并照相。

2 结果

2.1 hTERTp的PCR扩增结果 见图1。扩增的276 bp条带与预期相符。

图1 hTERTp的PCR扩增结果M:DNA Marker;1:hTERTp。

2.2 克隆载体pGEM-hTERTp的鉴定 pGEM-hTERTp菌落PCR鉴定结果见图2。NotⅠ酶切克隆载体pGEM-hTERTp,得到310 bp的目的基因和2 981 bp的线状片段(图3)。

2.3 重组载体pEGFP-C3的鉴定 AseⅠ和AgeⅠ双酶切重组质粒pEGFP-C3得到593 bp的CMV启动子片段和3 955 bp的载体片段(图4)。重组载体引入多克隆序列,经NotⅠ和NdeⅠ分别单酶切均得到3 986 bp的线性载体片段,与预期结果相符(图5)。

2.4 重组表达载体pEGFP-C3-hTERTp的鉴定

重组表达载体pEGFP-C3-hTERTp菌落PCR鉴定结果见图6。

图6 重组表达载体

2.5 重组表达载体pEGFP-C3-hTERTp在真核细胞中的表达 见图7。

图7 重组表达载体转染293A细胞(×100)A:pEGFP-C3-hTERTp转染组;B:阳性对照。

3 讨论

端粒酶在大多数恶性肿瘤细胞中处于激活状态,而在正常细胞中却失活,并且其活性高低与肿瘤恶化程度有关,是目前所报道的最广谱的肿瘤生物分子标记[5]。目前已发现的端粒酶组分中,只有hTERT在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性表达,且表达水平与肿瘤细胞端粒酶的活性一致[6],提示hTERT启动子可能是一个好的肿瘤特异性启动子,以hTERT启动子调控肿瘤治疗基因,可以达到靶向肿瘤基因治疗的目的。

作者采用PCR方法扩增了包含核心区的276 bp的hTERTp片段,并用其取代真核荧光表达载体pEGFP-C3原有CMV启动子,构建重组载体pEGFPC3-hTERTp。重组质粒转染端粒酶阳性的人胚肾293A细胞后,发现hTERTp能够启动绿色荧光蛋白GFP基因的表达。该研究为应用hTERTp作为转录调控元件,调控不同作用机制的治疗基因在多种肿瘤细胞中的特异性表达,实现肿瘤靶向性基因治疗奠定了基础。

[1]许晶虹.端粒酶与癌基因[J].实用肿瘤杂志,2002,17(4):288

[2]胡建,覃文新,万大方.端粒及端粒酶研究的最新进展[J].生命科学,2001,13(3):113

[3]李贺,张晓伟,张宗玉.端粒酶与肿瘤关系的研究进展[J].老年医学与保健,2001,7(3):181

[4]黄雁西,赵学军.端粒酶启动子结构及其调控[J].癌症,2001,20(6):667

[5]Nettelbeck DM,Jerome V,Muller R.Gene therapy:designer p romoters for tumour targeting[J].Trends Genet, 2000,16(4):174

[6]文忠.端粒酶催化亚单位在肿瘤特异基因治疗作用中的研究[J].肿瘤防治研究,2005,32(2):122