王 琳,徐春燕,刘新奎,师国珍#

1)郑州大学第一附属医院放疗科;河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室郑州 450052 2)郑州大学学报编辑部郑州450001 3)郑州大学第一附属医院病案管理科;河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室郑州 450052

#通讯作者,男,1947年10月生,主任医师,教授,研究方向:细胞药物时相与放射线细胞时相的结合治疗恶性肿瘤,E-mail: shiguozhen0371@126.com

目前,肺癌的发生率和病死率居世界癌症之首,是一种治愈率极低的恶性肿瘤。热疗是继手术、放疗、化疗与生物疗法之后的第 5种疗法。细胞培养、动物模型及临床应用均证明热疗可与化疗产生协同作用[1]。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,在细胞存活途径中起重要作用[2]。活化的 Akt,即磷酸化的Akt(p-Akt)在抑制细胞凋亡,促进细胞增殖、运动和侵袭等方面起重要作用[3],而以上各过程均与肿瘤的发生密切相关。研究[4-5]显示,多种肿瘤组织中存在p-Akt的高表达。该研究中作者将加热与临床常用的化疗药物紫杉醇联用,探讨热化疗对 H446细胞生长增殖、侵袭及Akt信号转导的影响,为阐明热化疗作用的可能机制和临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 细胞株:人小细胞肺癌细胞株H446为中国科学院上海生命科学院营养所馈赠。主要试剂:紫杉醇注射液(太极集团四川太极制药有限公司),噻唑蓝(Sigma公司),兔抗人Akt抗体和p-Akt(Ser473)抗体(美国Cell Signaling公司),辣根酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司),Akt特异抑制剂wortmannin(美国Alexis公司)。主要仪器:垂直电泳槽,电转仪,Sunrise酶标仪,恒温水浴箱。

1.2 实验分组 紫杉醇所用剂量参考临床常用剂量。按如下方式处理细胞:单纯化疗组(加入 120 μg/L紫杉醇,37℃培养24 h)、热化联合组(加入120μg/L紫杉醇,43℃水浴加热 40min,37℃培养48 h)、wortmannin组(加入120μg/L紫杉醇及1 μmol/L wortmannin 43℃水浴加热40 min,37℃培养48 h)及对照组(37℃培养48 h)。

1.3 损伤修复实验 取对数生长期细胞,常规消化制成单细胞悬液,接种于 24孔板中,每孔 1×105个细胞,每组设 3个复孔;待细胞完全融合时,用 20 μL Tip头在单层细胞上划痕,倒置显微镜下照相,记录划痕的原始大小,并按设计处理细胞;分别于划痕 24及 48 h后照相,记录划痕宽度的变化。

1.4 H446细胞增殖率检测 采用MTT法。取对数生长期的 H446细胞,常规消化制成单细胞悬液,调整细胞密度为2.5×104m L-1,接种于96孔板中,每孔0.2m L,置37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养24 h,待细胞贴壁,按实验设计处理细胞(每组设6个复孔,独立重复3次),之后放回37℃、体积分数5%CO2培养箱继续培养48 h;每孔加入5 g/L MTT液20μL,继续孵育4 h,取出培养板,弃去MTT液,每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO),微量振荡器振荡10 min,使结晶物充分溶解,以DMSO调零,酶联免疫检测仪检测492 nm波长下每孔的吸光度值(A),计算细胞生长增殖率,细胞生长增殖率= (实验组A值/对照组A值)×100%。

1.5 各组细胞p-Akt水平检测 离心收集各组细胞,将约1×106个细胞置于细胞裂解液中,在冰水浴中反复吹打进行破碎,4℃、10 000 r/min离心 10 min,吸取上清液,即为细胞提取液。进行总蛋白定量,调整蛋白浓度一致后,进行SDS-PAGE电泳,然后转移至硝酸纤维素膜上,分别以兔抗人Akt抗体和兔抗人p-Akt抗体为一抗,辣根酶标记山羊抗兔IgG为二抗,进行Western Blot分析,化学发光法显色后,应用GeneTool图像分析软件进行定量分析。

1.6 统计学处理 应用SPSS 13.0对数据进行处理,4组增殖率和p-Akt水平比较采用单因素方差分析,LSD法进行两两比较,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 损伤修复实验结果 划痕后24 h,对照组细胞开始向划痕区生长,划痕区中央可见散在的细胞,其余各组划痕区均未见细胞生长,且有部分细胞死亡,热化联合组细胞存活数少,加入 Ak t抑制剂组存活细胞数更少;划痕后 48 h,对照组细胞划痕区已填充,单纯化疗组细胞大部分存活,但仍存在较宽的划痕区,热化联合组和抑制剂组细胞大多已死亡。

2.2 各组细胞增殖率和p-Akt水平比较 见图1,表1。

图1 各组p-Ak t水平比较

表1 各组细胞增殖率和p-Ak t水平比较(n=3)

3 讨论

肿瘤热疗是一种新的肿瘤治疗方法,能够在有效的温度范围内提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,逆转肿瘤细胞的耐药[6],诱导细胞凋亡[4]。该研究结果显示,单纯化疗和热化疗均可使细胞增殖率降低,且热化疗联合对细胞增殖的抑制作用更强,提示加热可增加细胞对化疗药物紫杉醇的敏感性。

损失修复实验能模拟体内伤痕康复过程中细胞迁移的情况[7],较好地反映细胞的迁移能力[8],在一定程度上反映细胞增殖能力和修复能力[9-10]。该研究结果显示,与对照组相比,化疗和热化疗联合组细胞的迁移能力均受到严重影响,且热化疗联合组影响更大,划痕后不易长满划痕区,细胞濒于死亡。加入抑制剂后,存活细胞数目进一步减少。

Akt是体内重要的生存信号通路磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt中的关键分子。p-Akt水平的增加可导致PI3K/Akt细胞生存通路的活化,大多数肿瘤组织中都有p-Akt的过度表达[5],通过抑制Akt的表达和活化,不仅可以阻断它的致癌作用,而且可以阻断此通路上游多种致癌相关基因,如生长因子类癌基因、生长因子受体类癌基因、ras癌基因与PTEN抑癌基因等。因此,PI3K/Ak t通路是介导细胞存活的一条经典通路,抑制了其表达,细胞的存活率就会降低。该研究结果显示,p-Akt在对照组中高表达,在热化疗联合组中降低,在抑制剂组最低,与增殖率降低的趋势一致,推测热化疗抑制细胞增殖可能与抑制p-Akt水平有关。

p-Akt可以增加肿瘤细胞的运动功能,有助于癌细胞侵袭,同时可以促进肿瘤细胞的转移[11]。从该实验可以看出,热疗抑制肿瘤细胞的迁移可能与热疗减少p-Akt的表达有关。

综上所述,热化疗联合应用可抑制 H446细胞增殖,其作用可能是通过抑制Akt信号转导通路实现的。

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