甄 攀,张万明,王春艳

(1.河北北方学院理学院,河北张家口075000;2.河北北方学院医学院,河北张家口075000)

吴茱萸 [Evodiaru taecarpa]又名淡茱萸、吴萸,是芸香科植物吴茱萸接近成熟的果实,气味芳香,有小毒,入肝、肾、脾、胃经.有温中散寒、疏肝理气、降逆止呕、燥湿定痛、抑菌、驱蛔、抗血栓形成、利尿、抗肿瘤、抗缺氧、镇痛、升高体温等作用[1].

有文献报道[2],已经发现吴茱萸中含有多种化学成分,有生物碱类、柠檬苦素类、挥发油类、还含有花色甙、异戊烯黄酮、吴茱萸啶酮、脂肪酸类化合物、氨基酸类物质等.但吴茱萸中含有绿原酸,一直未见报道.我们在前期进行的色谱研究中发现吴茱萸中含有大量的绿原酸,并测定了绿原酸的含量[3,4].经过广泛的资料检索发现,有两篇硕士论文[5,6]中也提到吴茱萸中含有绿原酸.但这些研究都比较肤浅,不能确证吴茱萸中含有绿原酸.我们利用色谱和光谱相结合的方法,对这一问题进行了深入的研究,证明了吴茱萸中确实含有绿原酸.

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

(1)HP Agilent 1100 Series高效液相色谱仪,YWG-C18(10μm,250 mm×4.6 mm)色谱柱,紫外检测器,HP HPLC(3D)化学工作站.

(2)Waters 600高效液相色谱仪,Hypersil BDSC18(5μm,250 mm×4.6 mm)色谱柱,2996二极管阵列检测器,Empower化学工作站.

绿原酸对照品由中国药品生物制品检定所提供.

吴茱萸为市售药材,经河北北方学院中医学院赵恒成老师鉴定.

乙腈为色谱纯,乙醇、甲醇、磷酸为分析纯,水为三次蒸馏水.

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

第一种色谱条件：HP Agilent 1100 Series高效液相色谱仪,YWG-C18(10μm,250 mm×4.6 mm)色谱柱,紫外检测器.检测波长327 nm,柱温30℃,梯度洗脱,流动相和流速见表1.

表1 流动相和流速

第二种色谱条件：Waters 600高效液相色谱仪,Hypersil BDS C18(5μm,250mm×4.6mm,Thermo)色谱柱,2996二极管阵列检测器,检测波长327nm,柱温30℃.流动相分别为乙腈-0.5%冰醋酸和甲醇-0.5%冰醋酸,流动相和流速见表2.

表2 流动相和流速

1.2.2 供试品制备

吴茱萸于60℃干燥,粉碎,精密称定,置于具塞100 m l锥形瓶中,用20 m l 50%乙醇浸泡0.5 h,超声震荡提取40 min,过滤.残渣再用20 m l 50%乙醇超声提取30 min,过滤.滤液合并,定容为50.0 m l.进样前用0.45μm滤膜滤过.绿原酸对照品.

2 实验结果

2.1 第一种色谱条件下的色谱和光谱

在第一种色谱条件下,绿原酸组分的tR=14.4 min,吴茱萸和绿原酸对照品色谱图见图1,吴茱萸中绿原酸组分和绿原酸对照品光谱图见图2.

图1 吴茱萸 (A)和绿原酸对照品 (B)色谱图

图2 吴茱萸中绿原酸成分 (A)和绿原酸对照品 (B)光谱图

2.2 第二种色谱条件下的色谱和光谱

在第二种色谱条件下,共有四种流动相或流速,分述如下：

(1)流动相为乙腈-0.5%冰醋酸 (90∶10),流速0.8 m L/min,此条件下绿原酸组分的tR=9.7 m in,吴茱萸和绿原酸对照品色谱图见图3,吴茱萸中绿原酸组分和绿原酸对照品光谱图见图4.

图3 吴茱萸 (A)和绿原酸对照品 (B)色谱图 1—绿原酸

图4 吴茱萸绿原酸成分 (A)和绿原酸对照品 (B)光谱图

(2)流动相为甲醇-0.5%冰醋酸 (89∶11),流速0.8mL/min,此条件下绿原酸组分的tR=8.4min,吴茱萸和绿原酸对照品色谱图见图5,吴茱萸中绿原酸组分和绿原酸对照品的光谱图见图6.

图5 吴茱萸 (A)和绿原酸对照品 (B)色谱图 1—绿原酸

图6 吴茱萸中绿原酸成分 (A)和绿原酸对照品 (B)光谱图

(3)流动相为甲醇-0.5%冰醋酸 (85∶15),流速1.0m L/m in,此条件下绿原酸组分的 tR=11.4min,吴茱萸和绿原酸对照品色谱图见图7,吴茱萸中绿原酸组分和绿原酸对照品的光谱图见图8.

图7 吴茱萸 (A)和绿原酸对照品 (B)色谱图 1—绿原酸

图8 吴茱萸中绿原酸成分 (A)和绿原酸对照品光谱图

(4)流动相为甲醇-0.5%冰醋酸 (83∶17),流速1.0m L/min,此条件下绿原酸组分的 tR=14.1min,吴茱萸和绿原酸对照品色谱图见图9,吴茱萸中绿原酸组分和绿原酸对照品的光谱图见图10.

图9 吴茱萸 (A)和绿原酸对照品 (B)色谱图 1—绿原酸

图10 吴茱萸中绿原酸成分 (A)和绿原酸对照品 (B)光谱图

3 讨论

实验中使用了两种色谱仪,分别为 HP Agilent 1100 Series和Waters 600高效液相色谱仪;两根色谱柱分别为 YWG-C18(10μm,250mm×4.6mm)和 Hypersil BDS C18(5μm,250mm×4.6mm)色谱柱;两种检测器分别为紫外和2996二极管阵列检测器;两种化学工作站分别为Empower和 HP HPLC(3D)化学工作站;多种流动相分别为乙腈-0.4%磷酸、乙腈-0.5%冰醋酸和甲醇-0.5%冰醋酸,在甲醇-0.5%冰醋酸为流动相时又改变了多种配比或流速.在以上各种条件下得到的吴茱萸色谱图中绿原酸成分的保留时间与绿原酸对照品的保留时间一致,峰形相似;光谱图的形状一致,最大波长一致,充分说明吴茱萸中含有绿原酸成分.

长期以来中草药中化学成分的定性分析,是经过分离纯化,得到单体,再用四大光谱 (UV、IR、M S、NMR)联合解析,确定其结构和名称.不但需要昂贵的仪器,而且需要预先分离纯化,操作繁琐,耗费时间很长.随着计算机水平的提高,现在随色谱而建立的化学工作站功能十分强大,应充分发挥其在定性分析方面的作用.本文仅使用色谱仪,利用色谱图和光谱图相结合,就完成了绿原酸成分定性分析,过程简单,仪器简单,费用较低.

在前期对吴茱萸的研究中,偶然发现吴茱萸的色谱图中有一个色谱峰的形状和保留时间与绿原酸标准对照品的非常相近.经过广泛的资料检索,没有发现吴茱萸中含有绿原酸的相关报道.但仅凭色谱图和保留时间就确定吴茱萸中含有绿原酸,显然是不够的.将色谱图中相应组分的谱峰形状、保留时间、以及其光谱图的谱峰形状、最大吸收波长与标准对照品的相应指标对照,应是一种简单而实用的定性分析方法.我们利用此方法,首次确证了吴茱萸中存在绿原酸.

[1] 李时珍著,良石编译.本草纲目 [M].赤峰：内蒙古科学技术出版社,2008：362

[2] 张恒斌.吴茱萸化学成分及测定方法研究进展 [J].中国现代中药,2008,10(11)：9-13

[3] 甄攀,张万明,白雪梅,等.吴茱萸水溶性成分指纹图谱的研究 [J].中国药学杂志,2005,40(06)：411-414

[4] 张万明,甄攀,白雪梅,等.RP-HPLC测定吴茱萸绿原酸的含量 [J].中成药,2006,28(01)：130-132

[5] 张起辉.吴茱萸化学成分的研究 [D].沈阳：沈阳药科大学,2006

[6] 雷培海.吴茱萸指纹图谱的研究 [D].贵州：贵州大学,2006