种子纯度鉴定的常用方法及其在甜菜上的应用展望

2010-02-09吴则东王华忠

中国糖料 2010年1期

吴则东，王华忠，韩英

（1.黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室，哈尔滨 150080；2.中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点开放实验室，哈尔滨 150080；3.中国农业科学院甜菜研究所/黑龙江大学农作物研究院，哈尔滨 150080））

我国是农业大国，每年因生产销售假劣种子造成的坑农害农事件时有发生，给种子使用者造成减产或不可挽回的经济损失，给种子经营者和国家造成较大的负面影响。因此种子纯度鉴定就成为正确评定种子等级的主要依据。种子纯度鉴定是种子检验的中心，是对一批种子中个体与个体之间在特征特性方面典型一致性程度的检验和种子真实性的鉴定。世界各国都对种子的纯度鉴定给予高度的重视，而我国从2000年12月1日起开始实施《中华人民共和国种子法》，该法的实施对我国的种子生产经营者是一件具有历史意义的大事，使我国的种子生产经营有法可依，也为种子纠纷案件提供了法律依据，但是这一切都要以科学的种子纯度鉴定工作为依据。而种子纯度鉴定工作是一项复杂的工作，它涉及生物学、生物化学、遗传学及分子生物学等多方面的知识，而研究领域也从宏观发展到微观。本文主要对近些年来农作物种子主要的纯度鉴定方法作一综述，并提出未来甜菜种子纯度鉴定的发展方向。

1 种子纯度鉴定的常用方法

1.1 田间小区种植鉴定法

该方法是中华人民共和国国家标准农作物种子检验规程GB/T3543.5-1995规定的鉴定程序，是鉴定品种真实性和测定品种纯度的最为可靠、准确的方法。该方法能够观察、比较的性状较多，结果准确、可靠。是目前解决种子质量纠纷中最具有法律效力的检测方法。为使鉴定品种的特征特性充分表现，试验田要选择气候环境适宜、土壤肥力中等、肥力均匀，并有适宜的栽培管理措施的田块。小区设计采用符合田间统计要求的随机小区设计，设重复，设对照。种植时鉴定品种和对照标准品种要尽量在同一田块，株行距可适当增加。要保持品种的差异和品种的特征特性，要求不能间苗。尽量少用除草剂及植物生长调节剂。在植株的不同发育时期与标准样品进行比较对照，主要根据株形、株高、叶片数、叶色、叶片宽窄、花药颜色等做出评判，从而对不同品种加以鉴别。田间小区种植鉴定方式多种多样，可在当地同季、当地异季或异地异季种植鉴定。但该方法鉴定费工、费时且周期长，对鉴定人员、种植田块及田间管理要求较高。要求田间种植小区需要具有能使鉴定性状正常生长发育的气候、土壤及栽培条件，并对病虫害有相对的防护措施；要求鉴定人员具有丰富的经验，熟练掌握鉴定品种的特征特性，才能正确鉴别。

1.2 同工酶电泳技术

酶是生物代谢中的一种特殊蛋白质，同工酶是指同一生物体或同一组织中催化相同化学反应，结构不同的一类酶。其结构的差异来源于基因型的差异。在作物种子纯度鉴定中，常用的是多态性较强的脂酶和过氧化物酶，所用方法多为聚丙烯酰胺凝胶电泳法。这种电泳利用电荷效应，分子筛效应和不连续系统的浓缩效应，将蛋白质或由蛋白质组成的同工酶进行分离。该法分辨率高，不易与样品相互作用，具有热稳定、无色透明、纯度高等优点。因此是目前种子纯度鉴定中研究较多、应用较广的电泳方法。目前已经应用此法对向日葵[1]、玉米[2]、甜椒[3]等品种进行纯度鉴定。该方法在使用过程中对酶的提取和电泳条件要求严格，如分离胶的浓度、浓缩胶的高度、催化剂的浓度及用量、温度等等都对电泳的最终结果产生影响，某些同工酶的种类易随生活力和发育进程的变化而变化，从而对种子纯度鉴定产生不利的影响，因此需要不断的实验，找到适合某一作物的最好条件。

1.3 蛋白质电泳法

蛋白质电泳技术是从种子中提取蛋白质，在某些方面弥补了同工酶电泳的缺点。蛋白质的提取容易且无需低温条件，缩短了周期；蛋白质成分数量稳定，不受外界环境条件的影响。目前该方法在小麦种子酸溶蛋白和玉米种子盐溶蛋白的应用中比较多，效果也比较好。

1.4 DNA分子标记鉴定技术

通过对品种DNA的多态性即DNA碱基序列的差异进行分析，从而鉴别不同品种。该方法检测对象是品种的 DNA片段（基因），没有器官的特异性，在植物体的各个组织、各个发育时期均可检测；不受环境的影响，因DNA分子标记的数量极多，遍及整个基因组，这是同工酶和蛋白质电泳技术所无法比拟的；完全遵守简单的孟德尔遗传方式，并具有体细胞稳定性。目前DNA分子标记鉴定技术主要有以下几个方面。

1.4.1 RFLP 作为第一代分子生物学标记，RFLP技术主要包括以下基本步骤：DNA提取→用限制性内切酶酶切DNA→用凝胶电泳分开DNA片段→把DNA片段转移到滤膜上→利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段（Southern杂交）和结果分析。RFLP反映了DNA序列中核酸排列顺序的差异性。一个物种的DNA在限制性内切酶识别位点上发生了单个碱基突变、结构重排（包括缺失、重复、易位和插入）以及甲基化等，均可导致限制性片段长度的多态性。理论上讲，每一个品种就是一种基因型，通过分析大多可以找到相对应的RFLP指纹图谱，利用这个RFLP指纹图谱就可将这个品种与其它品种或混杂株区分开来。但该方法更费时、费力，需要进行DNA多种酶切、转膜以及探针的制备等多个步骤，检测周期长，成本高，还要用到放射性元素，因此在品种纯度鉴定应用上受到一定的影响，目前已经很少使用。

1.4.2 RAPD 该技术是1990年发明并发展起来的，RAPD是建立在PCR（Polymerase Chain Reaction）基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。其以基因组DNA为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序列（通常为10个碱基对）为引物，在热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）作用下，进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。RAPD技术现已广泛地应用于生物的品种鉴定上。但RAPD技术对反应条件十分敏感，因此RAPD标记检测作物种子纯度时，必须使RAPD反应标准化、程序化，这包括DNA的提取、RAPD反应混合物中各成分的浓度、电泳条件、溴化乙锭染色等；另外还必须建立每种作物品种种子纯度的RAPD检测技术操作规程，这样RAPD检测结果才可靠、准确。目前RAPD方法鉴定种子纯度已经在油菜[4]、西瓜[5]、南瓜[6]、水稻[7]等作物上进行了应用，取得了很好的效果。

1.4.3 AFLP 该技术是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。限制性片段用二种酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。它结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可做为一种分子标记。AFLP具有分析所需 DNA量少、可重复性好、多态性强、分辨率高、不需要 Southern杂交以及无放射性危害等特点。但是由于AFLP技术是一种专利技术，受专利保护，而且试剂盒价格昂贵，很难进行批量鉴定，操作过程较为复杂，对操作人员技术要求高，并且对DNA提取纯度和内切酶质量要求严格，一般人较难掌握，使其应用受到一定的限制。目前应用AFLP已经成功地鉴定了茶树[8]、白菜[8]及瓠瓜[10]等等。

1.4.4 SSR 该技术也称微卫星DNA，其串联重复的核心序列为1～6 bp，其中最常见是双核酸重复，即（CA）n和（TG）n，每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10～60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据染色带的差异来进行纯度鉴定。SSR具有以下一些优点：（1）复性温度高，扩增重复性好，结果稳定可靠；（2）微卫星呈共显性遗传，符合孟德尔遗传规律。故可鉴别杂合子和纯合子，对个体鉴定具有特殊意义；（3）SSR标记技术所需的DNA量少，仅需要微量组织。即便DNA降解，其亦能有效分析鉴别。因此目前应用SSR技术鉴定品种纯度应用比较广泛，如黄瓜[11]、马铃薯[12]、大豆[13]、水稻[14]等等。

1.4.5 SRAP 是一种新型的基于PCR的标记系统，该标记通过独特的双引物设计对基因的ORFs（Open reading frames）的特定区域进行扩增，上游引物长17bp，对外显子区域进行特异扩增。下游引物长18bp，对内含子区域、启动子区域进行特异扩增。因不同个体以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不同而产生多态性。该标记具有简便、高效、产率高、共显性高、重复性好、易测序、便于克隆目标片段的特点。目前SRAP技术在西瓜[15]、水稻[16]及花生[17]等作物的纯度鉴定上已经取得了一定的成果。

2 甜菜种子纯度鉴定的常用方法

目前甜菜种子纯度鉴定的微观方法还没有开展，对甜菜种子纯度鉴定方法通常采取田间小区种植法。如2008年10月，新疆伊犁州种子检测中心，首次开展了KWS9103甜菜种子真实性和品种纯度种植鉴定。以进口的KWS9103做对照，并进行了认真细致的田间记录和管理，保证了鉴定田植株长势良好。同时在甜菜幼苗期和成长期进行了鉴定。证明此方法可行。

3 甜菜种子纯度鉴定方法的展望

无论是田间鉴定技术还是生化鉴定技术，由于其鉴定的标记数有限，不能满足种子纯度和种质资源鉴定及育种工作的发展需要。目前国家加大了甜菜产业的投入，实施了甜菜现代产业技术体系建设，随着甜菜产业的繁荣，建立一套行之有效的甜菜种子纯度鉴定方法尤为重要，而甜菜基因组DNA的快速提取方法已经建立，相应的分子标记技术如RFLP、RAPD、SRAP、SSR等也已经应用成功，而SSR和SRAP具有信息含量高、遗传释义明确、重复性好、操作简单等优点，在品种真实性及种子纯度鉴定中具有良好的应用前景。而目前已经有数十个甜菜SSR位点被发现，SRAP引物更是多达上百对，因此在不久的将来，可望构建完全由SSR标记或SRAP标记组成的基因组图谱，建立DNA图谱档案和品种特有的DNA数据库；同时降低实验成本，使质检部门易于接受以及更加简化种子DNA提取程序。进一步推动SSR及SRAP标记在甜菜种子纯度鉴定中的应用，不久的将来会直接服务于农业生产，为甜菜种子纠纷仲裁作出科学的判断。

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