杜家琇 娄季宇 白宏英 曾志磊 杨霄鹏 王金兰

郑州大学第二附属医院神经内科 郑州 450014

研究证实，免疫炎症反应在缺血性脑损伤中发挥重要作用［1］，小胶质细胞（microglia，MG）是神经－免疫－内分泌系统的核心细胞，在中枢神经系统的免疫应答中发挥关键作用，和多种神经系统疾病的病理过程有关［2］，脑缺血后小胶质细胞大量表达、释放和（或）分泌多种神经毒性物质、炎性因子和酶导致继发性脑损害，其中iNOS是小胶质细胞影响脑缺血损伤进展的关键因素，其细胞定位以小胶质细胞为主［3］，由iNOS造成NO的过度释放，产生细胞毒性作用。因此，减少脑缺血再灌注MG的激活，可以起到神经保护作用［4］。抑制MG活化或减少其产生的神经毒性物质将是治疗脑缺血的新思路。环孢素A（cyclosporin A，CsA）是一种抗器官移植排斥反应的特效药物，近年来发现CsA可以降低小胶质细胞活性，有神经保护作用［5］，但在大鼠脑缺血－再灌注损伤方面的研究较少。本实验主要通过环孢素A干预小胶质细胞的活化及免疫炎性反应以减少病理损害，为临床治疗脑缺血性疾病提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物选择 健康SD大鼠72只，清洁级，雌雄不限，体质量（240±30）g，由郑州大学动物实验中心提供。

1.2 分组、给药方法 随机将大鼠分为假手术组、模型组、环孢素A组，每组24只，各亚组均为6只，干预组从手术后2h到手术后2周，每天腹腔注射环孢素A（20mg／kg），模型组和假手术组注射等体积的生理盐水。

1.3 脑缺血－再灌注模型的制备 参照Longa等报道的线栓法［6］并加以改进，制备局灶性脑缺血－再灌注模型（MCAO），栓线长45mm，线身直径0.26mm，线头直径0.34mm，距头端20mm做标记，术前12h大鼠禁食不禁水，模型组及环孢素A组均进行左侧大脑中动脉栓塞。栓线插入深度18～22mm，缺血120min时，拔出栓线约10mm，进行再灌注。假手术组仅分离颈总动脉。

1.4 模型动物神经功能缺陷评分标准及选择 神经功能缺陷评分按照Zea Longa 5分制评分标准［6］，0分：无神经系统功能缺失；1分：轻度局灶性神经功能缺失；2分：中度局灶性神经功能缺失（爬行时向瘫痪侧转圈）；3分：中度局灶性神经功能缺失（行走时向瘫痪侧倾倒）；4分：不能自发行走，有意识障碍。1～3分的动物模型为入选标准。

1.5 OX－42、iNOS免疫组织化学染色 各相关时间点大鼠在麻醉后经左心室灌注，即切开胸骨，经心脏灌注生理盐水，继用4%的多聚甲醛灌注固定，断头取脑，浸入固定液中过夜，脱水、透明、浸蜡，冠状位连续冰冻切片，片厚为4μm。免疫组织化学染色（SP），显微镜下观察OX－42、iNOS表达情况。

1.6 图像采集分析 采用德国Lecia显微照相系统采集图片，Biosens Digital Imaging System v1.6分析系统对 OX－42及iNOS的表达进行定量分析。每个标本随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下的阳性区平均灰度值，以5个视野的平均灰度值的平均值作为该例的测量值。

1.7 统计学处理 采用SPSS12.0统计软件处理，实验数据用均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析，组间比较采用t检验，α＝0.05为显著性检验性水准。

2 试验结果

2.1 神经行为学评分 大鼠局灶脑缺血／再灌注后各组神经行为学评分结果见表1。

表1 大鼠神经行为学评分 （）

表1 大鼠神经行为学评分 （）

注：与模型组比较，★P＜0.05

组别 n 1d 3d 7d 14d假手术组 24 0 0 0 0模型组 24 2.39±0.56 2.25±0.25 2.05±0.45 2.12±0.49环孢素 A组 24 2.20±0.35★ 1.93±0.72★ 1.82±0.13★ 1.88±0.13★

2.2 海马一区OX－42免疫组化检测分析 见表2。假手术组可见少许OX－42阳性表达的小胶质细胞，模型组1d即有OX－42的大量表达，3d时达峰，7d下降但仍高于正常，14d时接近正常，环孢素组较模型组表达减少，经统计学处理有显著性差异。

表2 3组各相应时间点海马CA1区OX－42阳性区平均灰度值 （）

表2 3组各相应时间点海马CA1区OX－42阳性区平均灰度值 （）

注：与假手术组比较，★P＜0.05，●P＞0.05；与模型组比较，△P＜0.05，□P＞0.05

组别 n 1d 3d 7d 14d假手术组 24 105.03±5.37 108.42±8.96 103.17±7.73 106.54±9.27模型组 24 135.60±5.11★ 154.97±4.62★ 125.31±4.32★ 105.31±3.15●环孢素 A组 24 122.92±3.46★△ 134.49±4.45★△ 113.82±5.80★△ 106.14±3.90●□

2.3 海马一区iNOS免疫组化检测分析 见表3。假手术组海马一区未见iNOS阳性表达，模型组1d时iNOS表达最高，3d时下降但仍高于正常，7d时接近正常，环孢素组较模型组表达减少，经统计学处理有显著性差异。

表3 3组各相应时间点海马CA1区iNOS阳性区平均灰度值 （）

表3 3组各相应时间点海马CA1区iNOS阳性区平均灰度值 （）

注：与假手术组比较，★P＜0.05，●P＞0.05；与模型组比较，△P＜0.05，□P＞0.05

组别 n 1d 3d 7d 14d假手术组 24 101.11±4.69 100.16±5.36 102.54±6.39 106.84±3.02模型组 24 148.69±5.09★ 126.32±6.65★ 105.37±4.12● 106.49±5.08●环孢素 A组 24 131.94±4.05★△ 115.19±5.75★△ 106.17±4.06●□ 103.94±3.44●□

3 讨论

缺血性脑血管病在脑卒中的发生率高达80%，无特效治疗方法。近年来，随着分子生物学、免疫学、病理学以及神经影像学等基础研究技术的发展，对其发病机制有了进一步的认识。脑缺血再灌注损伤总是伴随着免疫应答和炎症反应，这个过程中小胶质细胞起了关键作用，小胶质细胞是脑内重要、最活跃的免疫炎症细胞，调控小胶质细胞活化可能是干预缺血性脑损伤的方法之一，小胶质细胞在神经元损伤中的重要性将会是以后研究的重点［7］。本实验显示，急性脑缺血再灌注损伤后，大鼠海马一区小胶质细胞过度表达，较对照组明显减少（P＜0.05），应用环孢素A后，随着OX－42的减少，其神经行为学评分优于模型组，显示了小胶质细胞数量的增加与神经元受损程度相一致，与再灌后脑损伤的程度可能成正相关。

激活后的MG一方面与神经细胞直接接触，发挥直接的毒性作用，另一方面产生一系列细胞因子和神经毒性物质，和中枢神经系统免疫炎症级联反应关系十分密切，其中研究最多的是NOS，NOS分为神经元型一氧化氮合酶（nNOS）、内皮细胞型一氧化氮合酶（eNOS）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）3种亚型，iNOS主要由 MG在一定的环境条件下产。Ladecola C等［8］研究发现iNOS利用精氨酸、氧气和NADHP产生NO，是脑缺血再灌后损伤过程中的关键因素。我们试验结果表明，iNOS在脑缺血再灌后损伤过程中大量表达，其表达的程度和神经功能障碍的程度相一致。

环孢素A是一种特效的免疫抑制剂，近来研究发现环孢素A对脑缺血－再灌注损伤具有脑保护作用。研究表明其脑保护作用机制主要有几个方面：（1）抑制钙调神经磷酸酶（CaN）活性；（2）封闭线粒体通透性转换孔（MPTP），维持线粒体结构和功能；（3）降低小胶质细胞表达及活性。然而对于小胶质细胞方面研究很少，本实验主要从这方面入手，结果显示环孢素A组大鼠海马CA1区小胶质细胞及iNOS的表达较对照组明显减少（P＜0.05），神经行为学评分优于模型组，显示了环孢素A的神经保护作用在于抑制小胶质细胞和iNOS的活性。

资料表明，环孢素有诸多不良反应。在我们实验中，由于应用疗程短，未发现明显的不良反应，其治疗的安全性和有效性有待进一步深入研究。

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