于文广,王 郝,白 莹,符永鹏,王文英,吴冬青

(西部资源环境化学重点实验室,河西学院化学系,甘肃张掖 734000)

黄酮类化合物是具有酚羟基结构的一类还原性化合物,其生理作用具有多种多样性。

总黄酮广泛存在于植物界中,有良好的抗氧化性能和消除自由基、抗肿瘤、抗突变的作用[1]。自由基生物学研究认为,许多疾病与自由基导致的生物大分子如蛋白质、脂质以及 DNA氧化损伤有关,尤其是活性氧如超氧阴离子自由基、羟基自由基、脂质自由基与心脑血管疾病、糖尿病、癌症等密切相关[2]。本文采用微波辅助法提取 4种药用植物花中总黄酮类化合物,通过邻二氮菲 -Fe2+-H2O2体系和普鲁士蓝法,用分光光度法对 4种药用植物花提取物抗氧化性进行了研究,为进一步开发利用资源提供一定的理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

小瓣玫瑰 (Rose rugosaThunb.)(采集于甘肃省天祝县);大蓟刺儿菜花 (Cirsium japonicamDC.)(采集于甘肃省河西学院校园);百合花 (L ilium)(采集于甘肃省临洮县);夏至草花〔lagopsis supine(Steph.)IK.〕(采集于甘肃省陇西县)。材料洗净、阴干,粉碎备用。

1.2 主要试剂

芦丁 (生化试剂,中国医药 (集团)上海化学试剂公司)、邻二氮菲、双氧水、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、硫酸亚铁、三氯乙酸、三氯化铁等均为国产分析纯。

1.3 主要仪器

WFJ2100型可见分光光度计 (尤尼柯仪器有限公司);RE-52旋转蒸发器 (上海青浦泸西仪器厂);LG烧烤型微波炉〔乐金电子 (天津)电器有限公司〕;SHB-III循环水式多用真空泵 (郑州长城科工贸有限公司);国华 HH-6数显恒温水浴锅 (常州国华电器有限公司);LDZ4-0.8A低速自动平衡微型离心机 (北京医用离心机厂)等。

2 实验方法

2.1 黄酮类化合物提取

称取各样品粉末 5.000 0 g两份,加入 95%乙醇 100 mL,室温浸提 2 h后,进行微波低火提取3 min,提取结束后冷却抽滤,滤渣进行第 2次、第 3次微波提取,滤液合并,浓缩定容至 100 mL,备用。

2.2 总黄酮含量的测定[3]

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品 30 mg,用 80%乙醇微热溶解后,置于 50 mL容量瓶中,用 80%乙醇定容。再精密吸取 20.00 mL,用乙醇定容至 50 mL,摇匀,即得芦丁对照液,浓度为 0.24 mg/mL。

2.2.2 标准曲线的制备

精密吸取芦丁对照液 0.00、0.20、0.60、1.20、1.80、2.40、3.00、3.60 mL,分别置于 10 mL容量瓶中,补水至 4.00 mL,加入 5%NaNO20.40 mL,摇匀 ,放置 6 min后 ,加入 10%Al(NO3)30.40 mL,摇匀,再放置 6 min,然后加 5%NaOH溶液 4.00 mL,补水至刻度,放置 10 min后,在 510 nm处测定吸光度 (以试剂空白为参比),以芦丁浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标作图,得回归方程为:y=0.263 8x+0.006 7 R2=0.999 8,测定范围 0～0.9 mg。

黄酮含量 (mg/g)=x×d/w(d为稀释倍数,w为样品含量,g)

2.3 清除羟基自由基能力测定[4-5]

2.3.1 羟基自由基的检测

取两只洁净的 10 mL容量瓶,1号瓶中依次加入 5 mmol/L邻二氮菲溶液 0.50 mL,pH 7.4 PBS溶液 2.00 mL,7.5 mmol/L FeSO4溶液 1.00 mL,加水补至 10.00 mL,37℃下恒温水浴加热反应 1 h,在536 nm处测得吸光度为 A1;2号瓶中依次加入 5 mmol/L邻二氮菲溶液 0.50 mL,pH 7.4 PBS溶液2.00 mL,7.5 mmol/L FeSO4溶液 1.00 mL,0.2%过氧化氢溶液 1.00 mL,加水补至 10.00 mL,37℃下恒温水浴加热反应 1 h,在 536 nm处测得吸光度为A2。计算ΔA。

2.3.2 羟自由基清除率的测定

吸取 0.50 mL 5 mmol/L邻二氮菲溶液置于 10 mL洁净的容量瓶中,加入 2.00 mL pH值为 7.4的PBS溶液,混匀后加入 1.00 mL 7.5 mmol/L的 Fe-SO4溶液,充分混匀后加入 1.00 mL 0.2%过氧化氢溶液,水定容至刻度,在 37℃恒温水浴下反应 1 h后,然后以 536 nm波长下测定吸光度 A536(损伤)。同上法,加提取物后加过氧化氢,测定 A536(加药)。同上法,不加入过氧化氢和提取物测定 A536(未损伤)。

表观羟基自由基清除率 d计算方法如下:

2.4 提取物还原力的测定—普鲁士蓝法[6]

移取一定量的提取液,分别加入 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸盐缓冲液和 1%的 K3Fe(CN)6溶液各2.50 mL并混合均匀,混合液在 50℃保温 20 min后加入 2.50 mL 10%的三氯乙酸溶液,混合后 (3000 r/min)离心 10 min。取上清液 2.50 mL,加入 2.50 mL蒸馏水及 0.50 mL 0.1%的 FeCl3溶液。测定反应液在 700 nm处的吸光度值。用吸光度的大小表示还原力的强度。

3 结果与分析

3.1 各提取物中总黄酮含量

精密吸取一定量的样品备用液,根据 2.2.2节方法测定样品在 510 nm处吸光度值,代入回归方程,计算出样品中黄酮的含量,结果见表1。

表1 总黄酮含量 (mg·g-1 n=4)

由表1可知:不同药用植物花中总黄酮类物质含量存在较大差异,其中大蓟刺儿菜花的黄酮含量最高 (63.02 mg/g),夏至草花的黄酮含量最低(11.39 mg/g)。

3.2 各提取物清除羟基自由基能力

将 4种药用植物花提取液稀释成相同浓度,然后精密吸取不同量各样品提取液,按 2.3.2节的实验方法测定吸光度值,计算其清除率,结果见图1。

图1 提取液对羟自由基清除作用

图1表明,4种药用植物花提取液对羟基自由基均有不同程度的清除能力,清除能力存在较大差异。4种药用植物花中大蓟刺儿菜花清除率最弱,提取液用量为 5.00 mL时,清除率达到最高,但仅为21.67%;小瓣玫瑰花清除率随提取物用量增加而增大幅度较快,提取物用量为 2.00 mL时,清除率达到70.20%,但超过 2.00 mL反应液出现沉淀;夏至草花提取液用量超过 5.00 mL时清除能力趋于平稳;百合花提取液用量为 5.00 mL清除率达到最高为91.38%。药用植物花清除羟自由基能力与黄酮含量、结构有密切关系。

3.3 提取物的还原力

精密吸取一定量稀释后的各样品提取液,按2.4节的实验方法测定吸光度值,结果见图2。

图2 提取物还原能力研究

图2可知,4种药用植物花提取液均有一定的还原能力,还原能力与提取液量呈正相关,小瓣玫瑰的还原能力最强,用量为 0.90 mL时吸光度值超过有效读数范围。其余 3种药用植物花还原能力基本相当,用量超过 5.00 mL时 3者还原能力均趋于平稳。

4 结 论

(1)采用微波辅助法提取甘肃产 4种药用植物花中总黄酮类化合物省时、省能,能得到较高的提取率,是一条理想的提取黄酮类物质的途径。采用硝酸铝比色法测定总黄酮化合物含量的精密度在0.3401%～0.7433%,测量方法可靠性。4种药用植物花中,大蓟刺菜花中总黄酮含量最高为 63.02 mg/g,夏至草花中总黄酮含量最低为 11.39 mg/g,不同植物花总黄酮含量有较大差异。

(2)4种药用植物花提取液对·OH均有不同程度的清除能力。大蓟刺儿菜花清除羟基自由基能力最弱,用量为 5.00 mL时清除率仅为 21.67%;小瓣玫瑰清除羟基自由基能力最强,当小瓣玫瑰花用量为 2.00 mL时,清除率达到 70.20%。清除羟基自由基能力与黄酮含量、结构有关。

(3)4种药用植物花提取液均有一定的还原能力,在一定浓度范围内还原能力与黄酮含量呈正相关,4种药用植物花中,小瓣玫瑰的还原能力最强。

[1] 吕 琴,刘金宝.乙醇提取石榴皮中总黄酮工艺研究[J].中国现代应用药学,2006,12(8):114-115.

[2] 曹 炜,卢 珂,陈卫东,等.不同种类蜂蜜抗氧化活性的研究[J].食品科学,2005,26(8):352-3563.

[3] 王飞飞,余 芳,辛志宏,等.富硒绿茶功能成分的超声波提取技术及其抗氧化活性研究[J].食品科学,2007,28(1):142-147.

[4] 陈乃东,周守标,王春景,等.春花胡枝子黄酮类化合物的提取及清除羟基自由基作用的研究[J].食品科学,2007,28(1):86-91.

[5] 蔡仲景,陈仕江,尹定华,等.不同产地冬虫夏草清除羟基自由基作用的研究[J].中草药,2004,35(1):59-59.

[6] 杨再雍,刘 琨,杨 超等.正交试验法优选叶下珠多酚的提取工艺[J].广西轻工业,2006,97(6):41-42.