任红荣,姜洪芳,单承莺,李 娜,张卫明

(1.南京师范大学 生命科学学院,江苏南京 210097;2.南京野生植物综合利用研究院,江苏南京 210042)

香水莲花是睡莲科 Nymphaea水生宿根草本植物,属于大型睡莲类,既是重要的园林观赏花卉,又是生产切花的新兴品种。香水莲花的降血脂作用已经在动物实验中得到证实[1]。以香水莲花焙制的茶风味独特。坊间以香水莲花中的多糖胶敷面,据说有很好的嫩肤与美白作用。

近年来,微波因促进反应的高效性和强选择性及操作简便、副产物少、产率高及产物易提纯等优点,被广泛应用于生化蛋白水解及有机物萃取、酯化等反应中[2-3]。微波提取 (简称MAE)是通过微波处理和适当操作进行有机化合物萃取的新技术。本研究通过对微波提取香水莲花黄酮的工艺条件的探讨,对微波技术应用到黄酮的提取方面具有一定的实际意义。

1 材料与方法

1.1 材料

香水莲花带雄蕊的干燥花托:浙江省温州市三心美德投资有限公司提供。七月采摘,剥去萼片和花瓣,贴近花托基部切去花梗,鼓风干燥。

芦丁标准品:中国药品生物制品检定所,纯度99.9%。

1.2 试剂

95%乙醇:工业酒精;石油醚:分析纯,南京化学试剂有限公司

1.3 仪器与设备

高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;

电子天平 EL-410s 美国 Setra;

旋转蒸发器 RE-52AA 上海亚荣生化仪器厂;

WLD07S-05型微波设备 南京三乐微波技术发展有限公司;

TU-1800紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;

离心沉淀机LXJ-Ⅱ(4000 r/min) 上海医用分析仪器厂;

电热鼓风干燥箱 南京电器三厂。

2 方 法

2.1 标准品溶液的配置

精密称取 120℃常压干燥至恒重的芦丁 10.3 mg,以 75%乙醇为溶剂,定容至 50 mL容量瓶中,配置成 0.206 mg/mL的芦丁标准品溶液。

2.2 样品溶液的配置

称取香水莲花干粉 10 g,按 1∶10比例加入石油醚回流脱脂 2次,每次 2 h。脱脂后的香水莲花粉烘干后备用。精密称取 5 g脱脂的香水莲花干粉,加入 20 mL 70%乙醇热回流提取 2次,每次 2 h,过滤提取液,以适量 70%乙醇洗涤滤纸和滤渣,合并滤液及洗涤液并减压浓缩至浸膏,抽真空干燥。精密称取 0.02 g香水莲花干燥物,以 75%的乙醇为溶剂,定容到 50 mL的容量瓶中,配置 0.4 mg/mL的样品溶液。

2.3 测定波长的确定

采用三氯化铝显色法确定香水莲花总黄酮测定的波长。分别吸取标准品溶液和样品溶液 0.1 mL,以 75%的乙醇为溶剂,定容至 10 mL的容量瓶中,分别吸取 2 mL,加 2 mL 1%三氯化铝显色 10 min后在 200～600 nm波长范围内扫描,均以 1%三氯化铝为空白对照。

2.4 标准曲线绘制的方法

精密称取 120℃常压干燥至恒重的芦丁 20 mg,用 75%的乙醇定容至 100 mL作为母液。精密量取芦丁标准品溶液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,分别置于 25 mL容量瓶中,用 75%的乙醇定容。分别吸取 2 mL芦丁标准液加 2 mL 1%三氯化铝显色 10 min后,以 1%三氯化铝溶液作为空白对照,在波长 425 nm处测定吸光度值。以芦丁量为横坐标,吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

2.5 因素试验

在单因素试验中,选取乙醇浓度、微波功率、提取时间 3个单因素,确定其影响大小,固液比在正交设计中考察其对香水莲花黄酮含量的影响。

2.5.1 提取溶剂系统的选择

将香水莲花雄蕊粉碎至 40目,用石油醚热回流脱脂两次,每次 2.5 h,过滤,滤渣于 60℃烘箱烘干,密封待用。

准确称取 5.0 g 40目的脱脂香水莲花干粉,用质量分数 50%,60%,70%,80%的乙醇溶液浸泡2 h,于微波连续反应器中回流提取,微波功率350 W,提取时间为 60 min。提取液真空抽滤,减压浓缩成浸膏,真空干燥,称重 M。取 0.02 g加 75%乙醇加热溶解,于 25 mL容量瓶中定容,再以 1∶1的比例加入三氯化铝显色 10 min后,作为香水莲花总黄酮样品待测液,于 425 nm处测定吸光度。根据标准曲线回归方程计算得样品液黄酮量m。

计算:香水莲花黄酮得率 =[M ×m/0.02×5]×100%。

2.5.2 提取时间对香水莲花黄酮含量的影响

用 70%的乙醇溶液回流提取香水莲花黄酮 20 min、40 min、60 min、80 min,其它条件同 2.5.1节。2.5.3 微波功率对香水莲花黄酮含量的影响

在微波功率 150 W、200 W、250 W、300 W的条件下,用 70%的乙醇溶液回流提取香水莲花黄酮,其它条件同 2.3.1节。

2.6 香水莲花总黄酮提取工艺的优化

在前期试验的基础上,以香水莲花总黄酮得率为指标,选用 L9(34)正交试验,考察微波提取时间(A)、70%乙醇用量 (B)和微波功率 (C)对提取效果的影响,因素水平见表1。

表1 因素水平表L9(34)

3 结果与分析

3.1 测定波长的确定

经波谱分析,芦丁标准溶液在 425 nm处有最大吸收,样品在 425 nm处接近最大吸收。因此选择425 nm作为黄酮含量的测定波长。

3.2 芦丁标准曲线

根据 2.4节中的方法绘制的芦丁标准曲线见图1。求得到回归方程:y=0.025 1x+0.009 2;R2=0.999 2,表明芦丁在本实验涉及的浓度范围 4～40 μg/mL范围内呈良好线性关系。

图1 芦丁标准曲线

3.3 单因素试验

3.3.1 乙醇浓度对香水莲花黄酮得率的影响

图2 乙醇浓度对香水莲花黄酮得率的影响

试验采用不同浓度的乙醇溶液提取香水莲花黄酮,旨在讨论乙醇浓度对香水莲花黄酮提取效果的影响。试验结果表明,当乙醇质量分数升高到 70%～80%时,香水莲花总黄酮含量处于平台期。为了节省乙醇溶剂,故选择质量分数为 70%的乙醇为最佳提取浓度。这可能与黄酮类化合物的极性有关,因为微波提取的选择性主要取决于目标物质和溶剂性质的相似性;另外,提高乙醇浓度可以增加提取溶剂对物料的渗透性,提高黄酮类的溶解度。但在使用微波加热时,主要是物料中的极性分子尤其是水分子吸收微波能,产生大量的热量,使物料升温,乙醇浓度的增加减小了料液中水的比例,会使料液升温减慢,从而影响得率[4]。

3.3.2 微波时间、微波功率对香水莲花黄酮得率的影响

微波辐射在短时间内[5]对细胞膜的破碎作用比较大,溶出目的物多,所以得率上升较快;提取液中总黄酮含量随功率增大而升高,这可能是由于功率增大,加热速率就增大,因此分子运动速度加快,摩擦增加,物质的渗透、扩散和溶解速度加快,有利于有效物质由外层细胞转移到溶剂中。微波功率超过 250 W时,黄酮得率增加缓慢,故选定微波功率为250 W。

微波提取时间超过 80 min后,提取液总黄酮含量下降可能是强热效应对其产生了破坏作用,溶解出的杂质增多[6]。微波提取时间为 40 min与80 min时,黄酮得率相差不大,为了节约时间,故选定微波时间为 40 min。

3.4 正交设计试验 -提取工艺条件选择

以总黄酮得率为评价指标,由直观分析看出,影响香水莲花总黄酮提取效果的因素为 B>A>C,以料液比的影响最大;由正交实验结果可知,各因素对香水莲花黄酮得率的影响力大小依次为乙醇用量、微波提取时间、微波功率。其中微波功率和微波提取时间对微波连续反应提取香水莲花黄酮的效果影响不显著,乙醇用量影响显著,确定最佳提取工艺为A1B3C2,即乙醇溶液为 70%,液料比 25∶1,微波功率250 W,提取时间 40 min。

表2 正交试验结果

3.5 验证试验

按正交试验选取的最佳提取工艺条件 A1、B3、C2进行重复试验,所得结果重现性较好,黄酮得率较高,结果较为理想。结果见表3。

表3 提取工艺验证试验结果

4 结 论

本文采用改进的家用微波炉,用微波蒸馏法连续提取香水莲花总黄酮,该工艺简单可行,省时经济。此方法也适用于后续分离纯化工序中的含量测定。本研究微波连续提取香水莲花黄酮的最佳工艺条件为:乙醇浓度为 70%,微波功率 250 W、微波提取时间 40 min、液料比为 25∶1,最高总黄酮得率为2.166%,为香水莲花黄酮的工业化生产提供了基础数据和理论依据。

[1] 张卫明,姜洪芳,徐 辉,等.香水莲花降血脂作用的实验研究[J].食品工业科技,2009,30(2):111-112.

[2] 陈 猛,袁东星.微波法萃取辣椒中辣椒素的研究[J].食品科学,1999,10:25-27.

[3] 杨海燕.微波辐照诱导萃取缬草天然香料的研究[J].新疆农业大学学报,2000,21(2):85-88.

[4] 王 军,王 敏,李小艳.微波提取苦荞麦麸皮总黄酮工艺研究[J].天然产物研究与开发,2006,18:655.

[5] 龚盛昭,杨卓如,曾海宇.微波提取黄芪甲苷的工艺研究[J].中成药,2005,27(8):889.

[6] 李怡彬,郑明初,郑宝东.竹叶黄酮微波提取工艺的研究[J].农产品加工学刊,2006(1):48.