张晶波,李 达,崔京辉,吉彦丽,王丽萍,王永全

北京市西城区2005-2007年志贺菌毒力相关基因的检测与分析＊

张晶波,李 达,崔京辉,吉彦丽,王丽萍,王永全

目的 对西城区2005-2007年来收集的志贺菌进行毒力相关基因检测并分析其分布情况,同时建立多重PCR方法检测志贺菌。方法利用志贺菌中四个主要毒力相关基因 ipa H、ial、set1A、set1B的引物分别对所收集的志贺菌进行PCR方法检测与分析,并且建立了毒力相关基因多重PCR方法的反应条件。结果ipa H基因存在于所有志贺菌中,set1A、set1B基因仅存在福氏志贺菌中,ial基因在反复复苏的菌株中检出率有所下降,尤其以宋内缺失率高(49%);多重PCR方法检测志贺菌方便快捷,而且可以初步分型。结论志贺菌菌型分布发生了变化,毒力相关基因的分布也相应地有所不同;多重PCR具有志贺菌的快速诊断价值。

志贺菌;PCR;毒力相关基因;多重 PCR

细菌性痢疾是由志贺菌引起的一种急性肠道传染病,是法定乙类传染病,该病不但发病率高,并且存在日益突出的菌株变异和抗药性问题,对公共卫生和健康造成严重威胁〔1〕。目前,细菌分离培养和血清分型鉴定为细菌性痢疾的确诊依据,但耗时长,难以满足突发疫情中,病原体快速检测和及时控制传染源的需要。聚合酶链反应 (PCR)技术作为一种简单、快速、有效的分子生物学检测技术,已广泛应用于病原体快速检测当中,但针对志贺菌的菌型变化进行多种毒力基因的检测与比较还鲜见报道〔2-3〕。

本文针对西城区2005-2007年度医院肠道门诊分离的志贺菌株,用PCR方法对志贺菌四种毒力相关的 ial基因(invasion-associated locus)和 ipa H基因 (invasive plasmid antigen H)以及编码志贺肠毒素1(Shigella enterotoxin 1,ShET-1)的set1A和set1B基因〔4-6〕分别进行了检测与分析。

1 材料与方法

1.1 菌株 2005-2007年西城区各医院肠道门诊分离的志贺氏菌株95株,包括福氏志贺菌60株,宋内志贺菌35株。福氏志贺菌包括:未定型的福氏志贺菌4株,Ⅰa 5株,Ⅱa 10株,Ⅱb 4株,Ⅳc 37株。标准菌株宋内志贺菌A TCC 51060,A 2菌株为国家认监委考核样,肠侵袭性大肠杆菌 EIEC44825,出血性大肠杆菌(EHEC)A TCC 43889,肠致病性大肠杆菌(EPEC)A TCC 49105,肠炎沙门氏菌A TCC 14208。

1.2 试剂 引物由上海生物工程有限公司合成。Taq DNA 聚合酶 (5U/μL)、M gCl2(25 mmol/L)、10 mmol/L dN TP、10 ×PCR buffer、100 bp M arker,TAE(50×)电泳缓冲液购自上海生物工程有限公司;DL2000 Marker购自大连宝生物公司;琼脂糖(西班牙进口分装)购自鼎国生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 模板制备 将细菌接种在LB培养基上培养18h,接种环挑取适量菌苔于500μL dd H2O中,100℃水浴10 m in,12 000r/min离心10 m in,取上清于-20℃冻存备用。

1.3.2 引物 参见文献〔4-6〕,由上海生工公司合成,其序列见表1。

表1 检测痢疾毒力相关基因的PCR引物Table 1 Primers used to detect virlence-associated genes of Shigella spp.

1.3.3 PCR扩增体系及扩增条件 10×PCR buffer 2.5μL,10mmol/L dN TP 1L,25mmol/L M gCl24μL,Taq DNA 聚合酶 0.5μL,20μmol/L 引物各 1μL,DNA 模板 2μL,dd H2O 12μL,共计25μL体系。扩增条件 95℃5min;95℃30s,55℃50s,72℃45s,30个循环;72℃10 m in。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳,扩增产物大小见表1。

1.3.4 多重 PCR的扩增体系及扩增条件 10×PCR buffer 1.5μL,10mmol/L dN TP 2μL,25 mmol/L M gCl24μL,Taq DNA 聚合酶 0.5μL,20μmol/L引物分别为:ipaH各0.4μL;ial及set1A各 0.6μL;set1B 各 1.0μL,DNA 模板 2μL,dd H2O 9.2μL 共计25μL 体系。

1.3.4 多重PCR特异性检测 对肠侵袭性大肠杆菌 EIEC44825,出血性大肠杆菌(EHEC)A TCC 43889,肠致病性大肠杆菌(EPEC)A TCC 49105,肠炎沙门氏菌A TCC 14208进行检测。

2 结 果

2.1 志贺菌4种毒力基因 PCR鉴定结果 见表2。

根据表2,我们可以看到 ipa H基因在所有菌株中都检测到;ial在 FⅡa、FⅣc和宋内的菌株中有不同程度的缺失,尤以宋内缺失程度最高49%,而07年的18株宋内只有3株缺失,说明与传代有关;在宋内中未检到 set1A和 set1B基因,而 FⅡa、FⅣc中也有少量菌株缺失。

2.2 志贺菌4种毒力基因 PCR鉴定及多重 PCR方法的扩增产物分析 见图1。

表2 检测痢疾毒力相关基因的PCR结果Table 2 The resLts of virlence-associated genes in Shigella spp by PCRmethod

2.3 志贺菌多重PCR特异性分析 除在 EIEC菌株中检出ipa H基因外,其余均未检出。

3 讨 论

图1 4种毒力基因PCR扩增产物Fig.1 The PCR products of four virlence-associated genes in Shigella sp p M 1:DL2000 Marker;1:set1B product;2:set1A product;3:ial product;4:ipa H product;5:m PCR product;M 2:100bp DNA ladder Marker

与志贺菌毒力相关的基因主要的有两类,一类是细胞黏附和侵袭相关的,包括位于侵袭性大质粒上的 ial基因(invasion-associated locus),能够编码多种与侵袭相关的基因,是细菌侵袭所必需的,但在细菌培养传代时,该大质粒极易丢失,消除该质粒后细菌的致病力也随之消失;编码侵袭质粒抗原 H的ipaH基因(invasive plasmid antigen H)具有多拷贝,同时存在于染色体和质粒上,不随传代而丢失,PCR检测具有较高的敏感性和稳定性,可避免因基因突变、质粒丢失而导致的假阴性,PCR检测志贺菌的四个菌群,均得到特异的扩增片段〔9-12〕。另一类是编码志贺肠毒素的基因,位于染色体上的set1A和set1B基因编码志贺肠毒素1(Shigella enterotoxin 1,ShET-1),能够引起水样便的,ShET-1仅存在于福氏志贺菌中;位于侵袭性大质粒上的sen基因编码的志贺肠毒素2(Shigella enterotoxin 1,ShET-2),ShET-2存在于几乎所有的志贺菌型中〔13-15〕。除了上述几种主要的毒力基因外,还有一些毒力相关基因和调控基因,我们选择了其中具有代表性的四种毒力基因对分离的菌株进行了PCR检测。

通过四种毒力基因的PCR检测结果,我们发现ipa H基因在所有志贺菌和EIEC菌株中都检测到,该基因可以用于志贺菌检测的初步鉴定;尽管set1A和set1B基因在 FⅡa、FⅣc中有少量菌株缺失了,但在福氏志贺菌中基本均存在,而在宋内和痢疾志贺菌A 2中未检到,set1A和set1B基因可以作为福氏志贺菌的鉴定;ial基因在 FⅡa、FⅣc和宋内的菌株中有不同程度的缺失,尤以宋内缺失程度最高49%,但在2007年18株宋内中只有3株缺失,说明与传代有关,该基因代表志贺菌的致病力,因此,可以确定该菌是否具有毒力。我们所做的四种毒力基因PCR检测结果与文献报道〔7〕基本一致。在我们对西城区2005-2007年的志贺氏菌菌型分布情况进行分析结果表明,菌型从传统以 F2a为主转为以F4c血清型为主,而对3年来菌型分析中,又发现以F4c血清型为主正向以宋内志贺氏菌为主的方向转变〔7〕。在我们对3年菌株的基因检测结果中,FⅡa、FⅣc四种毒力基因多数都可以检测到,而宋内只检测到1～2个基因,因此,志贺菌菌型分布发生了变化,毒力相关基因的分布也相应地有所不同,我们从基因水平找到了菌型变异的依据。我们所检测的志贺菌四种毒力基因具有不同的代表性,因此,这四种毒力基因对于志贺菌的检测具有重要意义。

目前,国内还没有多重 PCR检测志贺菌的报道,由于单个或几个基因检测的方法都比较稳定,因此,我们建立了志贺菌四种毒力基因同时检测的多重PCR方法。尽管 EIEC中有 ipa H基因,但志贺菌具有感染性除了该基因,同时还具有 ial基因,据此,可以将二者区分开。该方法可以同时检测出四种毒力相关基因,根据产物的不同可以初步快速地确定志贺菌的型别,不同群的菌扩增产物的条带数量不同,可以快速鉴定志贺菌。多重PCR在疫情处理、临床诊断以及突发公共卫生事件中志贺菌的检测具有重要的应用价值。

〔1〕Qi Jin,Zhenghong Yuan,Jianguo Xu,et al.Genome Sequence of Shigella flexneri 2a,Insights into pathogenicity through comparison with genomesof Escherichia coli K-12 and O157〔J〕.Nucl Acids Res,2002,30(20):4432-4441.

〔2〕熊燕,罗同勇,余滨,等.武汉市2007-2007年细菌性立即监测病原菌分析〔J〕.中国卫生检验杂志,2008,18(9):1794-1796.

〔3〕贺电,张晓曦,单志兰,等.PCR检测技术在志贺菌引起的腹泻疫情中的应用〔J〕.中国卫生检验杂志,2007,17(5):858-860.

〔4〕Fasano A,Noriega FR,Maneval DR Jr,et al.Shigella enterotoxin 1:an enterotoxin of Shigella f lexneri 2a active in rabbit small intestine in vivo and in vitro〔J〕.J Clin Invest,1995,95:2853-2861.

〔5〕Frankel G,Giron JA,Valmassoi J,et al.Multi-gene amplification:simltaneous detection of three virLence genes in diarrhoeal stool〔J〕.Mol Microbiol,1989,3:1729-1734.

〔6〕Lüscher D,Altwegg M:Detection of shigellae,enteroinvasive and enterotoxigenic Escherichia coli using the polymerase chain reaction(PCR)in patients returning from tropical countries〔J〕.Mol Cell Probes,1994,8:285-290.

〔7〕张晶波,崔京辉,王丽萍,等.北京市西城区2005-2007年志贺氏菌菌型变化及药敏分析〔J〕.中国人兽共患病杂志,2008,24(10)982-984.

〔8〕Thong KL,Hoe SL,Puthucheary SD,et al.Detection of virlence genes in Malaysian Shigella species by m ltiplex PCR assay〔J〕.BMC Inf Dis,2005,5(1):8-15.

〔9〕Gaudio PA,Sethabutr O,Echeverria P,et al.U tility of a polymerase chain reaction diagnostic system in a study of amplification of different lociof the epidemiology of shigellosis endemic area.〔J〕.J Infect Dis,1997,176:1013-1018.

〔10〕Dutta S,Chatterjee A,Dutta P,et al.Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta,India〔J〕.J Med Microbiol,2001,50:667-674.

〔11〕Sethabutr O,Venkatesan M,Murphy GS,et al.Detection of shigellae and enteroinvasive Escherichia coli by amplification of the invasive plasmid antigen H DNA sequence in patients with dysentery〔J〕.J Infect Dis,1993,167:458-461.

〔12〕Yavzori M,Cohen D,Orr N.Prevalence of the genes for Shigella enterotoxins 1 and 2 among clinical isolates of Shigella in israel〔J〕.Epidemiol Infect,2002,128(3):533-535.

〔13〕Vargas M,Gascon J,Jimenez DM,et al.Prevalence of Shigella enterotoxins 1 and 2 among Shigella strains isol1ated from patients with traveler’s diarrhea〔J〕.J Clin Microbiol,1999,37(11):3608-36111.

〔14〕No riega FR,Liao FM,Formal SB,et al.Prevalence of Shigella enterotoxin 1 among Shigella clinical isolates of diverse serotypes〔J〕.J Infect Dis,1995,172:1408-1410.

〔15〕Rhee SJ,Wilson KT,Gobert AP,et al.The entero-toxic activity of Shigella enterotoxin 1(ShET1)is mediatedby inducible nitric oxide synthase activity〔J〕.J Pediatr Gastroenterol Nutr,2001,33:400-416.

Detection and analysis of virulence-associated genes in Shigella species in Xicheng district of Beijing from 2005 to 2007

ZHANG Jing-bo,L IDa,CU IJing-hui,JI Yan-li,WANG Li-ping,WANG Yong-quan
(X icheng District Center for Disease Control and Prevention in Beijing,Beijing 100011,China)

The objective of the p resent study was to detect the virulence-associated genes of Shigella species in Xicheng district of Beijing and in order to develop the multip lex PCR method for diagnosis.From 2005 to 2007,a total of 95 strains were detected and four setsof primers were app lied to amp lifyipa H,ial,set1A and set1B genes,respectively.A t the same time,a reaction condition was established for the multiplex PCR.Results indicated that the ipa H gene was p resent in all Shigella strains but the set1A and set1B geneswereonly p resent in all Shigella f lexneri strains.Mo reover,the positive rate of the ial gene in repeated recovery Shigella strains was decreased,and the deletion rate of Shigella sonnei was relatively higher(49%).Results indicated that the diverse distributions of the virulence-associated genes were according to the various distributions of strain typesof Shigella.Themultip lex PCR method developed a quicker and more convenientway for Shigella strains typing,and it had clinic significance for diagnosis in Shigella species.

Shigella;PCR;virulence-associated gene;multip lex PCR

R378.2

A

1002-2694(2010)03-0269-03

＊北京市优秀人才资助项目资助(20061D000700363)

北京市西城区疾病预防控制中心,北京 100120;Email:jingbo7099@hotmail.com

2009-07-16;

2009-12-11