金洪涛,夏志平,李 丹 ,薛慧亮 ,刘 军 ,连 海

一株致仔猪腹泻大肠杆菌的分离与鉴定＊

金洪涛,夏志平,李 丹 ,薛慧亮 ,刘 军 ,连 海

目的 对病死仔猪肠道内分离的大肠杆菌进行分离培养,通过常规生化反应及毒力基因和分型基因的分子生物学检测对分离株进行初步鉴定。方法应用多重PCR检测方法进行毒力基因的检测,经细菌16S rDNA全基因扩增测序,Flic基因扩增测序,Blast分析,对分离的大肠杆菌进行初步分型鉴定。结果通过对分离菌株基因组DNA的多重PCR分析,发现该菌株含大肠杆菌耐热肠毒素和不耐热肠毒素致病基因。通过细菌16S rDNA全基因扩增测序,Flic基因扩增测序,Blast分析显示该分离株为H10。其中16S rDNA全基因与H10菌株同源性在99%,Flic基因与H10菌株同源性在98%。结论所分离的猪肠道致病性大肠杆菌为 H10,其含耐热肠毒素和不耐热肠毒素致病基因。

腹泻;大肠杆菌;毒力基因;H10

猪大肠杆菌病是危害仔猪的一种细菌性传染病,主要引起严重腹泻,并造成仔猪脱水死亡。猪常见致病性大肠杆菌血清型包括 O8、O9、O20、O60、O138、O139、O149 等〔1-3〕并具有相应的菌毛和鞭毛。产肠毒素型大肠杆菌(ETEC)是猪的一种肠道病原菌,能够引起仔猪黄痢、白痢和猪的水肿病。

2009年4、5月份,在吉林省某牧业公司的多家猪场发生1月龄左右仔猪急性死亡,死前排黄色稀便,剧烈腹泻伴水样便。剖检见肠道严重出血,充气,肠壁稀薄,腹股沟、颌下淋巴结严重出血。本实验室对发病死亡仔猪的肠和肠系膜淋巴结进行了病原分离培养及初步鉴定,以指导临床诊断和防治,减少经济损失。

1 材料与方法

1.1 病料及菌株来源和培养条件 无菌采取吉林省某牧业公司猪场仔猪腹泻病死猪的肠和肠系膜淋巴结作病料。病料划线于麦康凯平板,37℃培养18h;挑取典型菌落在麦康凯平板上分区划线,37℃培养 18h,选取单个典型菌落纯培养后-80℃保存〔4-5〕。

1.2 引物 根据 GenBank中发表的序列,分别设计针对 elt(L T)、eaeA(Intim in)、inv A、ST 的四种毒力基因的特异性多重PCR检测引物,由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 主要试剂 麦康凯干粉培养基、购自 Sigma公司(美国);PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司;血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。其它常规试剂均为国产分析纯级产品。

1.4 常规生化反应鉴定 按照常规方法对分离的大肠杆菌进行生化鉴定。

1.5 PCR检测毒素和毒力岛特异致病基因基因按文献报道方法对分离株基因组DNA的elt(L T)、毒力岛 eaeA(Intimin)、inv A、ST基因进行多重PCR 检测鉴定〔3-5〕。

2 结 果

2.1 细菌分离和肠毒素基因PCR检测 病死猪的肠和肠系膜淋巴结病料划线于麦康凯平板,37℃培养18h,可见典型红色圆形菌落;挑取典型菌落在麦康凯平板上分区划线,37℃培养18h,选取单个典型菌落接种马林肉汤培养基小量培养后提取细菌基因组DNA,多重PCR进行致病基因检测,发现该菌株含耐热肠毒素和不耐热肠毒素致病基因,毒力岛eaeA(Intimin)、inv A致病基因 PCR阴性,说明该分离菌株基因组中不含上述致病基因。耐热肠毒素PCR特异性条带大小为164bp,不耐热肠毒素PCR特异性条带大小为685bp,见图1,分离株毒力特征为产肠毒素型大肠杆菌(ETEC)。

图1 单菌落基因组DNA多重PCR检测结果Fig.1 Single colony genome DNA multi-PCRam plification of virulence gene results M DNA marker(DL 2000);1 ST positive control;2-7 single colony genome DNA multi-PCR amp lification of virulence gene results;8 negative control;9 toxin gene positive control;10-11 t multi-PCR positive control;12 agent control

2.2 大肠杆菌分离株生化反应鉴定结果 见表1。

2.3 大肠杆菌16s rDNA全基因扩增测序,Flic基因扩增测序检测 对分离株的大肠杆菌16s rDNA全基因PCR扩增测序,并对Flic基因进行 PCR扩增测序,Blast分析显示该分离株为 H10。其中16s rDNA全基因与 H10菌株同源性在99%,Flic基因与 H10菌株(AF169320、AM 231654)同源性在98%,见表 2。

3 讨 论

大肠杆菌是主要的一类肠道非致病菌,但也有表1 生化反应鉴定结果

注:“”产不产气;“-”不反应

表2 菌种鉴定结果Table 2 Strain identification result

Table 1 Biochem ical event identification result一些大肠杆菌具有引起健康动物胃肠道、尿道或中枢神经系统疾病的能力。在分类学上大肠杆菌被列为埃希氏大肠杆菌科,埃希氏大肠杆菌属。就致肠道疾患的大肠杆菌来说,依据致病机理、临床症状和流行病学特点的不同主要分为7种类型,即产肠毒素性大肠埃希菌(ETEC)、肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠道聚集-黏附性大肠埃希菌 (EAAggEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠出血性大肠埃希菌(EHEC)、腹泻相关溶血性大肠埃希菌(DHEC)、产细胞肿胀致死毒素性大肠埃希菌(CDT-EC)。引起仔猪腹泻的大肠杆菌血清型随地区和时间不同而有所差异,世界范围内猪源 ETEC菌株多属于 O8、O9、O20、O45、O64、O101、O138、O139、O141、O147、O149 等血清型 ,国外发现致仔猪腹泻最常见的 ETEC属于血清型 O149、O8、O147,并能产生L T、STb 肠毒素〔1〕。H 10 菌株为引起婴幼儿和仔猪等剧烈腹泻的常见病原性大肠杆菌,引用生水或食用污染的食品饲料为主要原因,应该注意加强预防。

幼畜腹泻是严重制约畜牧业发展的主要问题之一,每年在世界范围内造成极大的经济损失。ETEC是引起幼畜腹泻的主要病原之一,其致病因子包括黏附素(adhesion)、肠毒素(Enterotoxins)、水肿病毒素(edema disease p rincip le,EDP)、内毒素(endotoxin)、溶血素(haemolysin)及 EatA等。本实验分离的大肠杆菌主要含有耐热肠毒素和不耐热肠毒素致病基因,肠毒素有耐热性肠毒素(heat stable entero toxin,ST)和不耐热性肠毒素(heat labile enterotoxin,L T)两种,二者单独或共同存在于所有ETEC中,是导致幼龄动物腹泻的直接致病因子〔2〕。

本研究分离的菌株为 H10,并且其对仔猪的致病性非常强,本实验室已经应用分离菌株培养后作为灭活疫苗进行相应流行猪场的免疫预防,但菌株的来源及其更进一步的菌株特性值得继续研究。随着基因组学、生物信息学、生物技术的发展和对ETEC的深入了解,会有越来越先进的方法来预防幼畜腹泻的发生。

〔1〕陈一兵,苗晓青,高崧,等.猪腹泻病例分离大肠杆菌的血清学分布〔J〕.中国兽医杂志,2008,44(9):36-37.

〔2〕Janke BH,Francis DH,Collins JE,et al.A ttaching and effacing Escherichia coli infections in calves,pigs,lambs,and dogs.〔J〕.J VetDiagn Investig,1989,1:6-11.

〔3〕陈祥,赵娟,高崧,等.我国部分地区猪源大肠杆菌LEE和 HPI毒力岛相关基因的检测〔J〕.中国人兽共患病学报,2006,22(1):33.

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Isolation and identification of pathogen ic bacterium which caused hemorrhagic diarrhea in newborn swine

JIN Hong-tao,X IA Zhi-ping,L IDan,XU E Hui-liang,L IU Jun,L IAN Hai
(Basic Veterinary Medicine Laboratory,Institute of M ilitary Veterinary M edicine,Changchun 130062,China)

The Escherichia coli(E.coli)strain from intestinal tract of died new born swine was isolated and cultured.Preliminary identification of the isolated strain was conducted by conventional biochemical tests,and the molecular biology detections of toxicity gene and typing gene were comp leted bymulti-PCR.Stable toxin and heat-labile enterotoxin genes of E.coli were detected from the isolated strain.By amp lifying and sequencing bacterial 16s rDNA and fliC gene,the isolated strain was identified as H10 by Blast analysis.The homology of strain H10 was 99%with bacterial 16s rDNA gene and 98%with fliC gene.

diarrhea;Escherichia coli;toxicity gene;H10

S852

A

1002-2694(2010)03-0209-02

＊国家科技重大专项(2009ZX10604)

夏志平,Email:jinhtao@126.com

军事兽医研究所基础兽医学研究室,长春 130062

2009-08-30;

2009-12-17