曹凌峰 罗飞宏 支涤静 程若倩 沈水仙 杨 毅

饮食和生活习惯等环境因素对肥胖的发生和发展起着十分关键的作用，但遗传因素构成了肥胖产生的内在基础。研究表明至少5%的肥胖儿童存在单基因的缺陷，而5%左右的肥胖存在复杂的多基因数量性状效应[1]。在FTO(fat-mass and obesity associated)基因研究中，单核苷酸多态性(SNP)与肥胖及其代谢综合征的关联研究是近10多年的研究热点和重点，既往研究报道了很多肥胖易感基因SNP，如浆细胞膜糖蛋白1(ENPP1)基因、脂联素(APM1)基因和转录因子7类似物2(TCF7L2)等，与BMI、胰岛素抵抗和肥胖高度相关，但研究结果不尽一致，提示基因多态性的效应存在人种和人群间的差异[2]。

在既往研究基因变异和肥胖及其相关代谢指标的关联研究中，一直沿用的基因组连锁分析和候选基因策略虽然成功地确定了某些与肥胖相关的基因或基因变异，但仅有少数能在不同人群和人种中重现。主要的原因是实验设计欠缺，表型评估差异，基因标记的选择不一和研究样本量的不同[3]。

全基因组关联研究(GWAS)是在全基因组范围内选择遗传变异进行基因分型, 比较病例和对照间每种变异频率的差异, 计算变异与疾病的关联强度, 选出最相关的变异进行验证并最终确认与疾病相关。通过对SNP与不同症状的相关性研究，最终确定这些SNP对于特定疾病患病风险的影响[4]。GWAS研究不需要预先对特定关联基因进行假设，因此主观理论对研究结果影响较小。

在上海市科技攻关基金项目(024119013)的系列研究中，对AMP1基因SNP276和浆细胞膜糖蛋白1(K121Q)与肥胖和(或)超重的相关性进行分析，采用的是国外候选基因策略所获得的关联位点[5]，未发现这2个基因多态性与中国汉族儿童代谢指标的相关性，可能与上述原因有关。而本文采用的是基于国外GWAS研究策略所获得的关联位点，以了解FTO基因SNP rs9939609、 rs1421085多态性与中国汉族儿童青少年单纯性肥胖及代谢指标间的相关性，为今后类似研究提供方法学选择的借鉴。

1 方法

1.1 研究对象、人体指标测量、代谢指标检测、基因分型和统计学方法 FTO基因SNP rs9939609、 rs1421085多态性的研究人群(纳入标准、排除标准、正常对照组的设计，伦理和知情同意)，空腹血糖受损的判断方法，胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、胰岛素敏感指数(QUICKI)的计算方法， DNA抽提方法，人体指标测量数据、一般资料数据、代谢指标检测数据、统计学方法均与参考文献[5]相同，在此不赘述。

本研究采用的基因探针型号为：rs 9939609:C_30090620_10;rs1421085：C_8917103_10,2×ABI Taqman Universal PCR master mix,No AmpErase UNG (lot No. E09854),20 ng基因组DNA模板,仪器采用ABI7900HT Sequence Detection System。重复性实验：随机取70份样品，约占总数的10%，基因分型结果与原先测定的结果完全符合。

rs9939609和rs1421085分型图见图1。

图1 FTO基因SNP rs9939609和rs1421085多态性的检测结果

Fig 1 FTO gene SNP rs9939609 and rs1421085 allele distribution plot

Notes A:rs9939609; B:rs1421085

2 结果

2.1 研究对象的基本情况 与正常对照组比较，肥胖+超重组的BMI、血清空腹葡萄糖(FPG)、空腹胰岛素(FIns)和三酰甘油(TG)水平均显著高于正常对照组(P<0.01)，具体数据见参考文献[5]。

2.2 基因分布频率的平衡性检验 rs9939609和rs1421085多态性的基因分布频率差异均无统计学意义(rs9939609：χ2=0.144,P=0.704；rs1421085:χ2=0.878,P=0.349)，基因型期望值与观察值吻合较好，符合Hardy-Weinberg平衡。

2.3 各组等位基因频率及基因型频率比较 肥胖、超重和正常对照组rs9939609分型成功率分别为94.9%(224/236例)、97.9(234/239例)和95.9%(231/241名)。rs9939609 AA基因型频率：肥胖组为2.7%，超重组为0.4%，正常对照组为1.7%；肥胖+超重组A等位基因频率显著高于正常对照组，P=0.048,OR=1.437，95%CI: 1.006～2.078(表1)。

肥胖、超重和正常对照组rs1421085分型成功率分别为92.8%(219/236例)、97.1%(232/239例)和95.4%(230/241名)。rs1421085 CC基因型频率：肥胖组为2.7%，超重组为0.9%，正常对照组为1.7%，肥胖+超重组C等位基因频率高于正常对照组，但差异无统计学意义，P=0.076，OR=1.388,95%CI:0.965～1.200(表2)。

2.4 FTO基因SNP rs9939609、rs1421085多态性与肥胖代谢指标间的相关性 rs9939609 TT基因型BMI显著低于TA+AA基因型(P=0.000 3)；rs1421085 TT基因型BMI显著低于TC+CC基因型(P=0.000 5)。rs9939609 TT基因型FPG、FIns、TG、总胆固醇(TC)、HOMA-IR、QUICKI与TA+AA基因型差异均无统计学意义；rs1421085 TT基因型FPG、FIns、TG、TC、HOMA-IR、QUICKI与TC+CC基因型差异均无统计学意义(表3)。

表1 肥胖组、超重组和正常对照组rs9939609等位基因频率及基因型频率比较[n(%)]

Notes OB:obesity group;OW:overweight group;NC:normal control group;1)obesity+overweight groupvsnormal control group,χ2=3.901,P=0.048,OR=1.437(95%CI:1.006-2.078);2)obesity+overweight groupvsnormal control group,χ2=5.57,P=0.061 7

表2 肥胖组、超重组和正常对照组rs1421085等位基因频率及基因型频率比较[n(%)]

Notes OB:obesity group;OW:overweight group;NC:normal control group;1)obesity+overweight groupvsnormal control group,χ2=3.148,P=0.076,OR=1.388(95%CI:0.965-1.200);2)obesity+overweight groupvsnormal control group,χ2=4.026,P=0.136 6

表3 FTO基因SNP rs9939609、rs1421085多态性与肥胖及其相关代谢指标间的相关性

Notes M:male;F:female

3 讨论

人类与肥胖相关的候选基因的数量有几百种，其SNP数量也相当庞大。1996年，Risch和Merikangas率先提出使用GWAS方法来确定基因多态性与疾病的相关性。近年来，随着人类基因组计划的顺利完成和国际人类基因组单倍型图计划(HapMap Project)的不断发展，以及高通量基因分型技术的成熟，使得同时研究几万，几十万，甚至几百万个SNP成为可能[6]，基因连锁分析或候选基因策略，仅能在单基因缺陷的疾病或特性中发挥重要作用，但在特定疾病的多基因遗传模式中，对确定多基因与复杂性疾病或特性的相关分析时作用相对有限。相对而言，GWAS能更精确地确定导致复杂性疾病的易感性基因,从而阐明这些复杂性疾病的遗传学发病机制,是目前科学界公认的最为有效的复杂疾病的研究方法。2006年后，相继有40多种复杂性疾病及其数量性状(如BMI和身高等)的GWAS研究报道，并发现了某些以往未检测到但与疾病或特性密切相关的基因和多态性位点，如FTO基因。

FTO基因位于染色体16q12.2，在藻类和脊椎动物中高度保守，但在无脊椎动物、真菌和绿色植物中不表达[7，8]。FTO基因属于非血红色加双氧酶家族，编码2-酮戊二酸-依赖型核酸脱甲基酶[9，10]。FTO基因mRNA在大脑内，尤其下丘脑mRNA的表达最丰富，但在其他组织也有表达[7，9]。动物实验研究发现，小鼠进食时下丘脑弓状核FTO基因mRNA表达水平上调，禁食时则下调[9，11]，但在大鼠中调控模式与此相反[7]，FTO基因能够使DNA去甲基化，并参与DNA修复、脂肪酸代谢和翻译后修饰。

2007年，Frayling等[12]率先报道了位于FTO基因第1内含子的rs9939609与成人和儿童肥胖具高度相关性，随后在欧洲几项独立研究中，也分别报道了该基因多态性与高加索人群、西班牙人群BMI和肥胖的相关性。FTO基因是至今为止在欧洲人群中唯一的、重复成功的肥胖易感基因[13]。在东亚地区，在有限的报道中结果并不一致。目前在中国仅见台湾、北京和上海地区的成年人群FTO基因多态性与肥胖的关联报道。Chang等[14]报道，FTO基因rs9939609多态性与中国台湾成人肥胖和BMI存在相关性，但与2型糖尿病无相关性；但在上海和北京的成人研究中未发现其与肥胖、BMI和糖尿病之间的关联性[15]。在日本人群的研究结果也不尽相同，Horikoshi等[16]未发现rs9939609多态性与BMI和肥胖的相关性；Omori等[17]研究得出阳性结果。提示研究结果可能与人群样本的选择有关。本研究发现，肥胖+超重组rs9939609 A等位基因频率显著高于正常对照组，rs1421085 C等位基因频率高于正常对照组，但差异无统计学意义；rs1421085 TC +CC基因型和rs9939609 TA +AA 基因型的BMI显著高于TT基因型。因此提示在中国汉族儿童青少年中rs1421085、rs9939609多态性均与肥胖的体脂形成有密切的关联性。

本研究正常对照组rs9939609 A等位基因和rs1421085 C等位基因的频率分别为9.7%和9.8%,其中A等位基因频率略低于中国台湾人群(12.6 %)[14]，而AA和CC的基因型频率均为1.7%, 与文献报道的结果一致[14]，但明显低于欧洲人群(45%)[18]和非洲裔美国人(21%)[13]，提示FTO基因该2个多态性位点基因频率存在显著的种族差异。

本研究人群的rs9939609和rs1421085多态性与BMI显著相关，但与肥胖其他相关代谢指标包括FPG、FIns、TC、TG和HOMA-IR等均无显著相关性；与日本[15]和中国[16]的研究结果较为一致。1项纳入17 037名高加索人群的Meta分析结果显示，FTO基因SNP rs9939609和rs1421085多态性与FPG、TG、FIns存在相关性[19]。提示rs9939609和rs1421085多态性对肥胖患者代谢指标的影响有种族和地区差异。

本研究首次证实了FTO基因多态性与中国汉族儿童青少年BMI的相关性，虽然其rs9939609 A等位基因频率远低于欧洲人群，但该等位基因对BMI的作用与欧洲人群较为相似，但对代谢指标影响却有所不同。由于中国是个多民族国家，在其他民族儿童青少年中FTO基因该位点多态性是否还有类似的作用，尚有待进一步研究证实。

本研究的不足之处与局限性：本研究对象仅限于上海某地区的汉族儿童青少年。作为全基因组相关研究，研究对象的数量尚显不足。

[1]Bouchard C. Childhood obesity: are genetic differences involved? Am J Clin Nutr,2009,89(5):1494-1501

[2]Bell CG, Walley AJ, Froguel P. The genetics of human obesity. Nat Rev Genet,2005,6(3):221-234

[3]Rankinen T, Zuberi A, Chagnon YC, et al. The human obesity gene map: the 2005 update. Obesity (Silver Spring)，2006，14(4): 529-644

[4]Kuniholm MH. Replicating genome-wide association studies. Science，2007，318(5849):390-391

[5]Cao LF(曹凌峰),Luo FH,Zhi DJ,et al.The relationship between SNP276 polymorphism of adiponectin gene and obesity in children and adolescents.Chin J Evid Based Pediatr(中国循证儿科杂志),2009，4(6):525-529

[6]Goodman E, Daniels SR, Morrison JA, et al. Contrasting prevalence of and demographic disparities in the World Health Organization and National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel Ⅲ definitions of metabolic syndrome among adolescents. J Pediatr,2004,145(4):445-451

[7]Fredriksson R, Hagglund M, Olszewski PK, et al. The obesity gene, FTO, is of ancient origin, upregulated during food deprivation and expressed in neurons of feeding-related nuclei of the brain. Endocrinology， 2008，149(5):2062-2071

[8]Robbens S, Rouzé P, Cock JM, et al. The FTO gene, implicated in human obesity, is found only in vertebrates and marine algae. J Mol Evol，2008，66(1): 80-84

[9]Gerken T, Girard CA, Tung YC, et al. The obesity-associated FTO gene encodes a 2-oxoglutarate-dependent nucleic acid demethylase.Science，2007，318(5855): 1469-1472

[10]Fernández AM, Kim JK, Yakar S, et al.Functional inactivation of the IGF-I and insulin receptors in skeletal muscle causes type 2 diabetes. Genes Dev，2001，15(15): 1926-1934

[11]Stratigopoulos G, Padilla SL, LeDuc CA, et al.Regulation of Fto/Ftm gene expression in mice and humans. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol ，2008，294(4):1185-1196

[12]Frayling TM, Timpson NJ, Weedon MN，et al. A common variant in the FTO gene is associated with body mass index and predisposes to childhood and adult obesity. Science，2007，316(5826):889-894

[13]Loos RJ, Bouchard C. FTO: the first gene contributing to common forms of human obesity. Obes Rev，2008，9(3):246-250

[14]Chang YC, Liu PH, Lee WJ,et al. Common variation in the fat mass and obesity-associated (FTO) gene confers risk of obesity and modulates BMI in the Chinese population.Diabetes，2008，57(8):2245-2252

[15] Li H, Wu Y, Loos RJ,et al. Variants in the fat mass- and obesity-associated (FTO) gene are not associated with obesity in a Chinese Han population. Diabetes，2008，57(1):264-268

[16]Horikoshi M, Hara K, Ito C,et al. Variations in the HHEX gene are associated with increased risk of type 2 diabetes in the Japanese population. Diabetologia，2007，50(12):2461-2466

[17]Omori S, Tanaka Y, Takahashi A,et al. Association of CDKAL1, IGF2BP2, CDKN2A/B, HHEX, SLC30A8, and KCNJ11 with susceptibility to type 2 diabetes in a Japanese population. Diabetes，2008，57(3):791-795

[18]Peeters A, Beckers S, Verrijken A,et al. Variants in the FTO gene are associated with common obesity in the Belgian population. Mol Genet Metab，2008，93(4)：481-484

[19]Freathy RM, Timpson NJ, Lawlor DA,et al. Common variation in the FTO gene alters diabetes-related metabolic traits to the extent expected given its effect on BMI. Diabetes，2008，57(5):1419-1426