张红栓,贾钰华,华何与,万中原,关山越,曹世平,崔 凯

(1.南方医科大学中医药学院,广东广州 510515;2.中山大学分析测试中心,广东广州 510275;3.南方医院心内科,广东广州 510515)

冠心病心绞痛是由于冠状动脉供血不足,心肌急剧的、暂时的缺血与缺氧所引起的临床综合征,属于中医学胸痹、心痛等范畴。通过对 5099例冠心病心绞痛病例的 57种证候类型研究表明,单因素证候中血瘀最多,其他依次为痰浊、阳虚、气虚、寒凝、血虚。

代谢组学是继基因组学、蛋白质组学等之后发展起来的以探讨机体整体代谢状态为目标的新方法。疾病引起的机体代谢水平紊乱往往会在尿液和血液等体液的代谢组得到表现。因此,对尿液和血液等体液代谢组进行检测和分析,就有可能对疾病发生和发展过程伴随的生物化学变化进行了解和认识,有可能发现相关疾病发生的早期代谢组标志物簇并认识相关的病理发生的分子机理,有可能对疾病在其早期甚至发生之前进行诊断。本研究利用代谢组学技术对冠心病心绞痛痰浊证、血瘀证进行了初步研究,试图通过患者尿液代谢物质的变化探索病证模式背后的生物标记物。

1 研究对象

1.1 研究对象来源及分组

选择 2008年 12月 ～2009年 9月在南方医院心内科患冠心病心绞痛(稳定型、不稳定型)的住院病人,经选择性冠状动脉造影确认为冠心病,经主任中医师辨证为痰浊证的患者 12例,血瘀证 12例。健康对照组为 6例通过体检确定其身体健康的志愿者,无痰浊证、血瘀证表现。3组性别、年龄经统计学处理,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 纳入标准

冠心病心绞痛诊断标准:参照国际心脏病学会和协会及世界卫生组织临床命名标准化联合专题组报告《缺血性心脏病的命名及诊断标准》,并经冠状动脉造影确诊。

痰浊证诊断标准。舌脉:舌苔胖大,边有齿痕,苔浊腻或白滑,脉滑或数。主症:心胸闷痛痞满,胸闷重而心痛微。次症:口黏乏味,纳呆脘胀,头身困重,痰多体胖。由主任中医师辨证入组。

血瘀证诊断标准。舌脉:舌紫暗,舌有瘀斑,舌下络脉青紫,苔薄,脉弦涩或结代。主症:心胸疼痛,如刺如绞,痛有定处,入夜为甚。次症:怔忡不宁,面色晦暗,唇青紫,发枯肤燥。

1.3 排除标准

不符合上述诊断标准者;急性心肌梗死、心肌炎、心脏神经官能症、肋间神经痛;其他疾病引起的心绞痛,如风湿热、梅毒、先天性冠状动脉畸形、肥厚型心肌病、主动脉瓣狭窄或关闭不全者;合并有脑中风、糖尿病、肺部感染、肾炎、肾功能衰竭、泌尿系感染、风湿病、肝、肾、造血系统、内分泌系统等严重疾病及骨关节病者;妊娠期或哺乳期患者,过敏体质患者。

2 研究方法

2.1 仪器与试剂

仪器:美国瓦里安公司(Varian,Inc.)INOVA 500MHz超导核磁共振谱仪,配备脉冲场梯度,带梯度场的三共振探头;离心机:德国 Eppendorf MiniSpin Plus。

试剂:重水(D2O),美国 Cambridge Isotope Laboratories,Inc.公司,99.9%;氘代氯仿,美国Cambridge Isotope Laboratories,Inc.公司 ,99.8%;氘代甲醇,美国 Cambridge Isotope Laboratories,Inc.公司,99.8%;3-三甲基硅烷基-2,2,3,3-四氘代丙酸钠(TSP),德国 Merck公司。

2.2 NMR实验前的样品配制

2.2.1 取材与处理

冠心病患者于入院第 2天(治疗前)取清晨空腹时尿液 5m L,经 13000r/min离心 10min。取上清3ml分装,-80℃保存。健康人也取清晨空腹时尿液,方法同上。

2.3 NMR数据采集

尿液在室温中解冻,取 500μl上清加入 250μl缓冲液(0.2mol/L Na2HPO4/NaH2PO4,pH=7.4),放置 10min,4℃,13000r/min离心 10 min。取上清液 500μl,添加 100μl的 TSP(1 mg/ml)混匀,转入5mm核磁管中进行测试。采用有预饱和的 1D NOESY脉冲序列,取如下参数:谱宽 8000Hz,混合时间 0.15s,驰豫延迟时间 2s,采样点数 32k,累加次数 64次;在驰豫延迟和混合期间采用预饱和方式抑制水峰,谱仪偏置设置在水峰的位置。自由感应衰减信号经过填零为 64k点之后,再加上 0.5Hz的线增宽因子,经傅立叶变换转换为 NMR图谱。以 TSP为化学位移参考峰,设此为 0ppm。用 MNOVA软件将所得谱图进行基线校正和相位调整,对 0.4ppm～9.4ppm的范围进行分段积分,每段为 0.04ppm,同时排除包含溶剂峰和尿素峰的部分(4.6ppm～6.2ppm)。将积分按每张谱的总积分强度归一化。所得数据输出并转换到 Excel文件保存。

2.4 NMR数据分析

将保存的 Exeel格式数据输入到 SIMCA-P+软件(vl0.5,Umetrics,Umea,Sweden)进行多元统计分析。数据采用平均中心化或 pareto标度化进行预处理之后,采用偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)。

3 结果

3.1 3组样本的典型1H-NMR图谱

冠心病心绞痛痰浊证、冠心病心绞痛血瘀证组尿液样品的典型1H-NMR图谱如下:

图1 3组尿液样本1H-NM R图谱比较

表1 2组尿液样本中主要差异代谢物

3.2 1 H-NMR图谱模式识别分析

冠心病心绞痛痰浊证组与血瘀证组尿液样本的1H-NMR谱的 PLS-DA分析结果见图2。从积分图可见,主成分积分值集中分布于椭圆形散点图(95%置信区内)的 4个区域,2组间无明显交叉和重叠。对1H-NMR谱变化值影响最大的 2个主成分对累积方差的贡献率为 80.3%。积分图上 2组样本间沿 t轴方向能较好地分开,说明组间差异显著。因子载荷图结合原始图谱可以找出差异代谢物的NMR峰化学位移值,2组尿液样本中差异性代谢物见表1。

图2 尿液代谢物 PLS-DA积分图(A)、因子载荷图(B)、三维空间图(C)

3 讨论

从1H-NMR图谱及模式识别分析发现,二组血浆样本之间存在显著的代谢产物谱差异:①2组的差异代谢物中与能量代谢有关的化合物有柠檬酸、α-酮戊二酸、顺式-乌头酸。柠檬酸与 α-酮戊二酸是三羧酸循环的中间产物,顺式-乌头酸是柠檬酸在乌头酸酶作用下异构化生成异柠檬酸的中间产物。痰浊证组上述物质含量较高,血瘀证组较低,提示可能痰浊证组三羧酸循环的能量代谢水平高于血瘀证组;②差异代谢物中与糖代谢有关的化合物有 β-葡萄糖。痰浊证组尿液中的葡萄糖含量高于血瘀证组,提示可能痰浊证组比血瘀证组存在更严重的糖代谢紊乱;③差异代谢物中与脂代谢有关的化合物有 3-羟基丁酸、丙酮。3-羟基丁酸与丙酮都属于酮体,酮体是脂肪分解的产物,糖代谢障碍和脂肪不完全氧化时酮体在体内积聚使血酮升高,多余的酮体经尿排出。痰浊证组的尿酮体含量比血瘀证组高,提示可能由于糖代谢紊乱导致的继发性脂肪代谢紊乱比血瘀证严重;④差异代谢物中与氨基酸代谢有关的化合物有酪氨酸、组氨酸,二者均为非必需氨基酸。酪氨酸在促进能量代谢、清除自由基、延缓疲劳等方面均有积极作用。组氨酸在人体中是组胺的前体,组胺能扩张血管,降低血压。痰浊证组的酪氨酸含量比血瘀证组高,组氨酸含量比血瘀证组低,可能提示血瘀证组氧自由基的增加与血管收缩比痰浊证组严重;⑤与肾功能变化相关的化合物有肌酐、氧化三甲胺。尿肌酐主要来自血液,经过肾小球过滤后随尿液排除体外,肾小管基本不吸收且排出很少。对于肾功能下降的患者而言,尿肌酐测定与血肌酐刚好相反,尿肌酐越高,一般说明肾脏排除肌酐毒素的功能越强。冠心病患者常同时合并高血压和糖尿病,而后两者常累及肾脏导致肾功能受损;同时冠心病患者也常伴有肾动脉粥样硬化,引起顽固性肾血管性高血压、肾组织梗死以及动脉粥样硬化性固缩肾,从而导致肾功能下降。氧化三甲胺是一种反映肾脏问题的生物标志物,有促进肌肉组织生长的作用。痰浊证组尿液肌酐、TMAO含量比血瘀证组高,可能提示血瘀证组比痰浊证组更容易出现肾功能损害;⑥与肝胆、胃肠功能变化相关的化合物有胆汁酸、二甲胺、马尿酸。胆汁酸作为胆汁的主要成分,可以反映肝脏分泌、肝脏合成与代谢、肝细胞损害的情况。一般而言,血中胆汁酸增高则尿中胆汁酸增高,提示肝功能受损。痰浊证尿液中尿胆汁酸含量较高,提示血瘀证组比痰浊证组更容易出现肝功能损害。二甲胺和马尿酸来自于消化道微生物产生的腐败产物,二者含量升高反映肠道微生物菌群的失调,腐败产物的增加可能是一些肠道疾病的原因。痰浊证组尿二甲胺和马尿酸含量较高,提示痰浊证比血瘀证组更容易出现胃肠功能紊乱。既然心绞痛证型与肾肝胆脾胃功能有关,正所谓“五脏六腑皆令心痛,非独心也”,那么心痛病本在心,法当调治本脏;若与其他脏腑有关,法当明辨标本,调治相关脏腑;⑦本次试验未解决的问题是,血瘀证组在化学位移为 0.60、0.48、0.40、0.44、8.80、9.24ppm处的未知化合物含量明显高于痰浊证组。

冠心病心绞痛 2种证型的尿液1H-NMR图谱能被区分并确定其中的差异代谢产物。它们与能量代谢、糖代谢、脂代谢、氨基酸代谢及肝肾胃肠功能的异常相关,提示代谢组学方法检测到的体内小分子化合物的含量变化可能是中医分型的物质基础。中医学和代谢组学均是对影响机体整体状况的多因素的研究对机体某一病理变化的全面情况进行探究。二者之间理论上的关联以及本研究的结果,为中医辨证分型客观化研究提供了新思路,为揭示中医学证的本质提供了新方法。