郑 毅 刘源慧 邓琳芬



响应面法优化米曲霉α-淀粉酶液体发酵培养基

郑 毅 刘源慧 邓琳芬

福建师范大学生命科学学院

应用快速有效的响应面分析法对米曲霉α-淀粉酶的发酵培养基进行优化。首先采用二水平Plackett-Burman设计对培养基中的6种成份进行筛选,获得影响产酶的3个重要影响因子：豆粕粉、NaNO3、FeSO4；利用响应面分析法对该3因素进行3水平的优化,获得它们的最佳组合（g/L）:豆粕粉 25.5、NaNO34.08、FeSO40.0075。优化后产酶水平达到1107.41U/mL，与响应面数学模型的预测值只有4.02%的误差。

α-淀粉酶 Plackett- Burman设计 响应面分析法

淀粉酶是水解淀粉和糖原的一类酶的总称，广泛存在于动物、植物和微生物中[1]。淀粉酶是生物工艺学中最早实现工业生产的酶制剂品种，用途广，产量大[1]。α-淀粉酶是淀粉酶的一种，其作用于淀粉时，可从分子内部切开α-1，4键而生成糊精和还原糖，产物的末端葡萄糖残基C1碳原子为α-构型，α-淀粉酶因此而得名[1]。α-淀粉酶作为一种重要的工业酶制剂，被广泛地用于食品，发酵，纺织，造纸业，制药业和化学药品工业等工业，此外还扩展到临床，医学，分析化学等其他领域。目前国内主要利用细菌来生产α-淀粉酶，用真菌发酵产α-淀粉酶的研究较少[2]。

本研究报道利用数学统计学法Plackett – Burman和响应面法（RSM）[3,4]快速优化米曲霉液体发酵产α-淀粉酶的发酵培养基。

1 材料与方法

1.1 菌种

米曲霉()FS016，本实验室保藏。

1.2 培养基

斜面培养基(g/L):蔗糖 30、NaNO32、K2HPO4·3H2O 1、MgSO4·7H2O0.5、KCl 0.5、FeSO4·7H2O 0.01、麸皮 10、琼脂10，初始pH为6.5，灭菌温度121℃，灭菌时间23 min。

液体发酵培养基(g/L)：玉米粉 50、豆粕粉 20、NaNO34、K2HPO4·3H2O 3、MgSO4·7H2O1、FeSO4·7H2O 0.01,初始pH为6.5，灭菌温度121℃，灭菌时间23 min。

1.3 培养条件

由斜面接一环至 250 mL三角瓶中，培养基装量 40 mL/250 mL，发酵温度31℃，250rmin-1的摇床上震荡培养84h后，测定α-淀粉酶活力。

1.4 α-淀粉酶活力的测定

YOO改良法[5],酶活定义为：在pH5.0，温度55℃条件下，1 mL的酶液在5min内水解1mg淀粉的酶量为一个活力单位，用U表示。

1.5 发酵培养基优化

1.5.1 Plackett-Burman 设计优化

选取6个因素、试验次数选12的Plackett-Burman设计，重复次数为2次，考查各因素的主效应和交互作用的一级作用，从中筛选出对发酵优化具有显著性影响的因素进行排列，最终获得三个显著性因素。

1.5.2响应面设计优化

根据BOX-Behnken的中心组合设计原理，由Plackett-Burman设计筛选出的3个重要影响因素各取三水平，设计了3因素3水平共15个实验点的响应面分析。

本实验用统计分析软件SAS对实验结果进行分析[6]。

以上所有试验重复次数为三次，每次两个平行。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman 设计筛选培养基主要成分

选用试验次数N=12的Plackett-Burman设计，对6个因素进行考察，分别对应于表1中A、B、D、E、G和H列，每个因素取低水平“-1”和高水平“1”。另设2个虚拟序列，对应表1中的C和F列，以考察试验误差。试验设计与结果见表1。

用SAS软件的二水平设计分析各因素的主效应,结果见表2。各因素对产酶影响顺序为:豆粕粉> FeSO4> NaNO3>玉米粉,利用响应面分析对豆粕粉、NaNO3、FeSO43个培养基组分进行更深入的研究。

表1 N = 12的 Plackett - Burman的试验设计与结果

（C）、（F）：虚拟列

表2 各因素的主效应

2.2 响应面设计优化培养基

将Plackett-Burman设计确定的3个重要因素,即豆粕粉、 FeSO4、NaNO3分别记为X1、X2、X3，以发酵酶活作为响应值，记为变量Y，利用Box-Behnken的中心组合设计,三因素各取3水平列表(见表3),设计了3因素3水平共15个试验点的试验设计，试验设计及结果见表4。

利用SAS统计软件的二次响应面回归（RSREG）进行数据分析，参数值见表5，得到拟合二次回归方程如下：Y=922.139933-5.133875000X1-15.381950000X2-15.933200000X3-44.37449167X1*X1-39.55369167X2*X2+76.29510833X3*X3+9.436200000X1*X2+35.56700000X1*X3+61.25020000X2*X3。

从表4可知，该模型计算出的拟合值与实验值较好吻合，平均拟合误差只有1.29%。该模型可信度分析见表6。从表6可知，二次响应面回归模型是显著，二次响应面回归模型是显著（决定系数R2=0.9288）,模型拟合程度较理想,说明这3个因素及其二次项能解释Y变化的92.88%,模型回归P值为0.0210,回归显著,所以该模型可用于米曲霉产α-淀粉酶发酵优化的理论推测。

表3 三因素和三水平取值

表4 发酵优化实验 Box-Behnken设计矩阵和响应数据的实测值与拟合值

表5 参数估计表

表6 模型方程方差分析表

2.3 培养基最适组合

在获得回归非线性模型和响应面以后，为了求得培养基最适浓度组合，对已回归的非线性模型方程求一阶偏导，并令其等于0，得到了三元一次方程组，得到曲面的最大点。求解此方程组得到最大产酶水平的最佳培养基浓度组合：X1=-0.448(25.5g/L)；X2=-0.916(4.08g/L)；X3=-1(0.0075g/L)，预测值为1064.58U/mL，即产酶水平最高时的最佳培养基组成（g/L）：玉米粉 50、豆粕粉 25.5、NaNO34.08、K2HPO4·3H2O 3、MgSO4·7H2O1、FeSO4·7H2O 0.0075,初始pH为6.5。

2.4 回归模型的验证

以该法选出的最适培养基浓度进行发酵试验,发酵水平达到1107.41U/mL，试验值与模型计算值相差+4.02%，可见该模型可以较好地预测实际的发酵情况，说明响应面分析法用于优化发酵培养基是可行有效的[7]。

3 结论

对米曲霉F016α-淀粉酶液体发酵培养基进行优化，经Plackett-Burman设计优化确定三因素，并取三水平，根据Box-Behnken设计试验矩阵进行实验得到数据后，进行响应面回归分析得到最佳培养基配方（g/L）：玉米粉 50、豆粕粉 25.5、NaNO34.08、K2HPO4·3H2O 3、MgSO4·7H2O1、FeSO4·7H2O 0.0075,初始pH为6.5。 最终酶活力为1107.41U/mL，比初始水平提高了12.54%，α-淀粉酶酶活力有了显著提高，达到实验预期目标。

[1] 张树政.酶工业制剂,下册[M].北京:科学出版社,1998.

[2] AshokP .Poonam N ,et al.Advance in Microbial Amylase. Biotechnol. Appl. Biochem.2000.31:135-152.

[3] 欧宏宇,贾士儒. SAS软件在微生物培养条件优化中的应用[J].天津轻工业学院学报, 2001,1(36):14-17.

[4] 王万中.实验的设计与分析.北京:高等教育出版社,2004.

[5] 史承利,姜涌明,蹙飚等.五种α—淀粉酶测活方法的比较研究[J].微生物学通报,1995,22(1):23-24.

[6] 阮桂海.SAS统计分析实用大全[M].北京:清华大学出版社, 2005.

[7] 郑毅,周彪等.产耐温蛋白酶苏云金芽孢杆菌FS140液体发酵条件优化[J].应用与环境生物学报,2007,13(5):708-712.