郑绍斌 徐国兴 林泰南 张晓娟 黄晓敏



兔角膜中央厚度与角膜上皮厚度的相关研究

郑绍斌1徐国兴1林泰南2张晓娟1黄晓敏1

1.福建医科大学附属第一医院眼科准分子激光中心 2.福建省级机关医院

目的：探讨兔的角膜上皮厚度在A型超声下与共焦下测量结果的相关性，及表麻药对角膜上皮的作用。方法：分析左右眼之间的统计学差别后，将20只兔子随机分为两组，一组滴用表麻药为实验组，另一组点用平衡液作为对照组，分析表麻药对角膜上皮的影响；最后将对照组用同样方法处理后，将40只眼的角膜上皮在A超下与共焦下的测量值进行统计学分析。结果：（1）兔的眼别与角膜中央厚度的测量差异无统计学意义；（2）滴用倍诺喜表麻液与滴用平衡液两组差异有统计学意义；（3）A超下测量角膜中央厚度与角膜上皮厚度，二者呈正相关；（4）A超下与共焦下的测量的角膜上皮厚度呈正相关。结论：倍诺喜表麻液会使角膜上皮厚度增加,可使角膜上皮的松解，可以缩短乙醇浸泡角膜上皮的时间；A超下测量角膜中央厚度越厚，其角膜上皮厚度越厚；A超下测量角膜上皮越厚，其共焦下测量角膜上皮也越厚。

兔 角膜上皮厚度 A型超声 共焦显微镜

活体的角膜中央厚度（CCT）的测量方法有A型超声波角膜测厚仪、UBM、光学裂隙灯测厚仪、眼前节光学相干断层扫描、Orbscan裂隙扫描角膜地形图/角膜测厚系统及共焦显微镜等,其中超声角膜测量法是为准确的测量方法。我们用超声测量法测量CCT。这些方法现多用于临床测量,而测量死后角膜厚度的方法目前报道很少。活体的角膜通过普通切片来测量将会产生很大的误差,因为在制片过程中的脱水会造成角膜的皱缩，从而影响角膜测量的准确性。因此，本实验通过对兔的活体与死体角膜上皮之间关系的相关性研究；以及表麻药物对角膜上皮影响的研究，为以后更广泛地应用于临床实践提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及主要仪器材料

四川大学医学实验动物中心提供健康新西兰大耳白兔20 只40 眼。兔龄3~4月；重量1.9~2.2kg；,雌雄兼用；经裂隙灯检查均无眼前节病变。

A型超声角膜测厚仪（DGH.technology INC.exton.PA.USA），美国思博明科学器材公司，在共聚焦显微镜图像分析系统下进行角膜厚度测量。应用图像分析系统本身载物台标本移动距离测量角膜上皮厚度。

0.4%倍诺喜滴眼液（日本参天制药株式会社）。

1.2 手术方法及实验分组

实验动物编号，耳缘静脉注射水合氯醛后，采用随机数字表法随机取实验动物1只眼作为实验组，另1只眼作为对照 组。再对20只兔采用区组随机法,分成2组,每组10只。A型超声角膜测厚仪测量中央角膜厚度各3次取平均值。

1.3 组织病理学研究

取材固定：用显微镊于兔的角膜中央固定区取直径约6mm的角膜上皮,立即测量去上皮角膜厚度，同时标本固定于4%中性甲醛中4 h,常规脱水、角膜上皮沿中央剪开，竖立石蜡包埋，5μm厚连续切片,常规HE染色，直接用共聚焦图像分析系统进行角膜上皮厚度测量。

1.4 图像分析

图像分析系统对HE染色标本进行角膜上皮测厚。上皮厚度的计算方法是取切削区中点、边界点以及两点之间的中心点,共5个点,上端起于上皮表面,下端止于基底膜上,平均值即为角膜上皮厚度。

2 步骤

2.1 水合氯醛自兔耳缘静脉注入，待兔进入全麻状态后，乙醇消毒铺巾，用复方乳酸林格液做溶剂的8%妥布霉素溶液冲洗结膜囊。

2.2 测量角膜厚度统一用A超，点一滴表麻药（0.4%倍诺喜）于结膜囊内（约2cm高度）60秒后进行，测三次结果取平均值。

2.3 将新鲜配制的浓度为20%的乙醇溶液（lmL纯度为99.7%的无水乙醇中加入4.0mL注射用蒸馏水）0.15mL置于上皮环钻内，浸润时间25s后，吸血海棉吸干乙醇，BSS立即充分冲洗，避免损伤上皮。同时A超角膜测厚仪立即测量去上皮后的角膜中央厚度。

2.4 取下的角膜和角膜上皮片固定:在4℃下，4%的甲醛溶液中固定4小时（4℃），0.1mol/L的磷酸缓冲液中漂洗1小时(换液3次)。再逐级脱水：60%乙醇 (20分钟)，70%乙醇 (20分钟)，80%乙醇 (20分钟)，95%乙醇 (25分钟)，无水乙醇 (25分钟)，二甲苯（20分钟），浸蜡，包埋。角膜上皮及角膜平铺，显微镜下沿中央剪开，竖立包埋角膜上皮及角膜后，纵向切片5μm厚连续切片。

2.5 切片组织苏木素—伊红(HE)染色，共聚焦显微镜下图像分析系统测量角膜上皮厚度。

2.6 统计学处理所有数据均使用SPSS11.5统计处理软件包。组之间进行统计学分析比较，组内各小组之间进行统计学分析比较，数据以均数±标准差(X±S)表示，采用检验及二元变量相关分析。以<0.05时差异有统计学意义。

3 结果

3.1 未麻时左右眼A超的角膜厚度值结果如下（n=20，单位：μm）：

右眼 左眼 t P 357.55±16.5 350.50±13.02 2.27 0.128

3.2 滴用倍诺喜表麻液（实验组）与滴用平衡液组（对照组）结果如下（n=20，单位：μm）：

倍诺喜组 平衡液组 t P 360.75±17.53 351.30±15.76 1.79 0.041

P＝0.041＜0.05，有统计学意义；说明表麻液可使角膜上皮厚度增加。

3.3 A超下角膜中央厚度与角膜上皮厚度的测量值如下（n=40，单位：μm）：

角膜中央厚度 角膜上皮厚度 r p 348.50±19.02 25.00±5.50 0.579 0.037

采用二元变量相关分析，相关系数r=0.579，P＝0.037，说明二者呈正相关；即A超下的角膜中央厚度越厚，其角膜上皮厚度越厚。

3.4 A超下与共焦下的角膜上皮厚度的测量值如下（n=40，单位：μm）：

A超下 共焦下 r p 25.00±5.50 16.56±6.93 0.593 ＜0.001

采用二元变量相关分析，相关系数r=0.593，P<0.001，说明二者呈高度相关；即A超下的角膜上皮越厚，共焦下的角膜上皮越厚。

4 讨论

许多实验和临床现象都说明渗透压对于维持角膜处于一个脱水状态是一个不可缺少的因素[1]。活体角膜之所以能够始终保持透明和相对脱水状态,是通过角膜内皮细胞的主动的代谢性液泵作用和把房水与角膜基质隔开的机械性屏障作用来实现的。人体或动物死亡后角膜内皮进入到基质,使得基质层肿胀,而基质层占角膜厚度的90% ,故而使角膜增厚,透明度下降；活体的角膜厚度的测量方法有很多种, 如A型超声波角膜测厚仪、UBM、光学裂隙灯测厚仪、眼前节光学相干断层扫描、Orbscan裂隙扫描角膜地形图/角膜测厚系统及共焦显微镜等。其中超声波角膜测量法是较为准确的测量方法[2，3]。我们用超声测量法测量CCT。这些方法现多用于临床测量,而测量死后角膜厚度的方法目前报道很少。活体角膜通过普通切片来测量将会产生很大的误差,因为在制片过程中的脱水会造成角膜的皱缩，从而影响角膜测量的准确性。因此，我们将角膜上皮剥离后立即置于4%甲醛中固定。我们通过对兔的活体与死体角膜上皮之间关系的相关性研究，为以后更广泛地应用于临床实践提供依据。

我们在对各组左眼、右眼角膜中央厚度比较，用统计学分析（成组T检验），发现左右眼角膜中央厚度没有显著差别，说明在该研究中眼别的影响不大。这与多数学者研究报道相似。现多数研究报道CCT与性别，年龄无显著性意义[3，10]。故我们就不对CCT与性别、年龄之间关系进行研究，直接对成年雌雄兔研究。

对于LASEK手术，其优势是要制作高生物学活性的角膜上皮瓣[4]，多数学者[5，6，7，8]现较一致认为20%乙醇作用于角膜上皮细胞的浸润时间应为20~30 s，在本实验中我们浸泡时间亦为25s。Espana[9]等人用免疫荧光染色的方法研究浸润于20％乙醇20～25s后并施以LASEK 手术的角膜上皮瓣。得出结论：乙醇浸泡后制作出的上皮瓣，其分离层面位于上皮基底膜的透明层和致密层之间。我们对于倍诺喜表麻药作用的研究，测量的角膜厚度均有统计学意义，说明倍诺喜表麻药可增加角膜上皮的厚度，也可促使角膜上皮的松解，或许可缩短乙醇浸泡角膜上皮的时间。我们在研究中均由同个人滴入兔眼结膜囊，高度为2cm（瓶口距眼睑水平面）。由于倍诺喜在24s就起效，可维持9~11min，为了使药物充分起效，我们选择滴药后60s进行研究。

我们对A超下角膜中央厚度与角膜上皮厚度与的相关分析（采用二元变量相关分析），二者呈正相关（r=0.579，P＝0.037）；因此A超下兔角膜中央厚度与角膜上皮厚度呈正相关，即角膜越厚，角膜上皮就越厚，这为我们以后研究提供可行性。

A超下角膜上皮厚度与共焦显微镜下角膜上皮厚度相关分析（采用二元变量相关分析），说明二者高度相关（r=0.593，P≤0.001）；本实验活体角膜上皮厚度是用A型超声角膜测后仪测量的角膜厚度减去去角膜上皮的角膜厚度；最后我们也把对照组用同种方法去角膜上皮，使该相关研究的例数增加为40例。因此，经过统计学分析后，共焦显微镜下兔的角膜上皮厚度与A超下角膜上皮厚度呈正相关，即A超下测量角膜上皮越厚，其共焦下测量角膜上皮也越厚。为以后进一步研究角膜上皮与角膜厚度之间的关系提供相关依据。

尽管我们发现角膜上皮随角膜厚度而变化，,且相关性强,较真实地反映实际情况。但本研究是动物实验,动物与人存在种属差异,且我们采用的均是健康兔,死因一致,同时还控制了温度和湿度等实验条件。这样,和日常人所处的环境条件、个体差异、健康状况、手术条件等影响均相似[10]。因此,必须了解各种影响因素对其作用规律,才能使角膜厚度与角膜上皮的相关性研究更加合理，准确，为以后更广泛进一步地应用于临床实践提供依据。

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福建省科技厅重点项目基金资助(2006Y0013)。