侯泽江 徐 巍 郭 健 徐国兴



人骨髓间充质干细胞诱导分化为RPE样细胞的探讨

侯泽江 徐 巍 郭 健 徐国兴

福建医科大学附属第一医院，福建省眼科研究所

目的：探索骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外定向分化成视网膜色素上皮（RPE）样细胞所需的微环境。方法：采用淋巴细胞分离液梯度离心法分离纯化BMSCs，第一阶段将培养第3代的细胞以bFGF、EGF及BDNF三种因子首先进行向神经前体细胞诱导分化，应用免疫细胞化学检测诱导细胞巢蛋白表达情况，当巢蛋白阳性表达率达到最高时去除诱导因子，进行第二阶段与第三代人RPE细胞共培养诱导2w，两阶段诱导后均采用免疫细胞化学及RT-PCR方法检测角蛋白及RPE65蛋白表达情况。结果：免疫细胞化学检测方面，诱导第3d开始能检测到巢蛋白表达，第12d阳性表达率达到最高，达（86.9±2.6)%，第一阶段诱导后见角蛋白表达，未见RPE65蛋白表达，第二阶段诱导后见角蛋白表达，阳性率为（60.8±3.1)%，见RPE65蛋白表达，阳性率为（25.7±3.8)%。RT-PCR检测方面，两阶段角蛋白与RPE65蛋白结果与免疫细胞化学检测结果一致。结论：体外采用分阶段诱导法，应用因子bFGF、EGF、BDNF及与RPE细胞共培养的微环境作用下能在体外诱导BMSCs表达RPE细胞标志物角蛋白以及RPE65蛋白。

骨髓间充质干细胞 分化 视网膜色素上皮细胞 共培养

视网膜色素上皮（Retinal Pigment Epithelium，RPE）细胞组织学上来源于神经外胚层，具有重要的生理功能，但是视网膜色素上皮细胞无再生能力，因而，当其功能障碍时会导致严重的遗传性、变性性视网膜病变，如视网膜色素变性等，目前通过药物和手术均不能阻止其进展、恶化。通过视网膜干细胞途径达到视网膜再生是一条希望之路，但是哺乳类动物视网膜干细胞成年后则很少具有活性，因此，外源性视网膜细胞移植可能是一个有希望的途径。

可直接应用于移植的视网膜干细胞非常有限，组织工程学的兴起为外源性视网膜干细胞的产生带来了新的希望，骨髓间充质干细胞（BMSCs）是至今研究最值得关注的成体干细胞，骨髓间充质干细胞是来源于中胚层的多能成体干细胞，大量的实验证实体外不同的微环境对BMSCs具有不同的诱导分化效果。BMSCs不仅能向中胚层的成骨细胞等分化，而且能跨胚层分化，如向内胚层的肝细胞样细胞以及外胚层的神经干细胞样细胞等分化。本实验探索诱导BMSCs向视网膜色素上皮细胞定向分化的微环境,现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM-LG培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（Hyclone, USA）；bFGF、EGF、BDNF、PEDF(Peprotech,USA)； Taurine（Sigma,USA）；淋巴细胞分离液（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）；小鼠抗人巢蛋白单克隆抗体、小鼠抗人角蛋白8＆18单克隆抗体、小鼠抗人RPE65单克隆抗体（NeoMarkers，USA）；流式细胞术试剂小鼠抗人单抗CD34-FITC+小鼠抗人CD90-PE，小鼠抗人单抗CD34-FITC+小鼠抗人CD44-PE（Beckman-Coulter，USA）, RT-PCR试剂盒（Fermentas，USA），transwell双层共培养系统（Corning，USA）。

1.2 方法

1.2.1骨髓的采集、BMSCs 的分离与培养

骨髓取自健康成年捐赠者，实验符合国务院1994年颁布的《医疗机构管理条例》第33条原则。抽取骨髓约5mL，将骨髓用PBS稀释后以1000rpm离心5min，洗涤2次，将下层血浆用等量DMEM-LG培养基重悬后采用淋巴细胞分离液（相对密度为1.077kg/L）密度梯度离心分离，轻轻吸取白色雾状单核细胞层，置于离心管中再次用PBS洗涤2遍，用含10%FBS的DMEM-LG培养基吹打分散后调整细胞密度为1×106/mL接种于25cm2塑料培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。72h后予以首次换液，以后每3d换液1次。

1.2.2 BMSCs的形态学观察与细胞表面抗原的流式细胞仪检测

倒置相差显微镜下观察原代及传代细胞形态学变化及增殖情况，并拍照记录。按照谢茂松等[1]对骨髓间充质干细胞的流式细胞术鉴定方法步骤进行，第3代人BMSCs 90%融合时用胰蛋白酶消化，用流式细胞仪检测BMSCs CD34（造血干细胞表面抗原），CD44（基质细胞表面抗原）及CD90（干细胞表面抗原）的表达情况。

1.2.3 RPE细胞的采集、分离与培养

RPE细胞取自福建医科大学附属第一医院眼科角膜移植术后的供体眼球，具体操作方法按照徐国兴等[2]提出的步骤进行，无菌条件下行眼杯消化法消化RPE层，将消化液中和后离心，用含15%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。72小时后开始首次半量换液，以后每3天换液一次，当细胞贴壁密度达80%时消化传代。

1.2.4 RPE细胞的免疫细胞化学检测鉴定

RPE65蛋白检测：收集细胞爬片进行RPE65蛋白的免疫细胞化学检测：PBS洗涤，4%多聚甲醛固定，5%正常羊血清封闭，加入小鼠抗人RPE65蛋白单克隆抗体（稀释度为1：100），4℃过夜，滴加聚合物辅助剂及生物素化山羊抗小鼠IgG， DAB显色及苏木素复染，自来水洗涤后干燥，树脂封片，显微镜下观察，拍照。

1.2.5诱导分化

实验分两组：诱导组和对照组。诱导组分两阶段诱导：首先向神经前体细胞诱导分化，再进一步与RPE细胞共培养向RPE细胞专向诱导分化。取第3代人BMSCs按 5×104/mL密度接种六孔板中，培养基为含10% FBS的DMEM-LG，每个六孔板中预先放盖玻片进行爬片，24h后将培养基更换为含20ng/mLbFGF、20ng/mLEGF及 20ng/mLBDNF进行第一阶段诱导，在因子诱导的2d开始进行巢蛋白的检测，检测到巢蛋白表达率最高时进行第二阶段诱导，采用transwell双层非接触共培养体系，将第一阶段诱导的BMSCs接种于transwell下层并爬片，取第三代RPE细胞接种于transwell上层，进行共培养诱导并观察细胞形态变化，对照组采用含10% FBS的DMEM-LG培养基培养，不加任何干预。

第二阶段向RPE样细胞方向诱导后角蛋白及RPE65蛋白表达的免疫细胞化学检测,角蛋白8＆18及RPE65蛋白抗体稀释度均为1:100。

1.2.6共培养诱导前及共培养2w后采用RT-PCR方法检测角蛋白及RPE65蛋白表达情况

第二阶段诱导前和诱导2w后，收集细胞，Trizol裂解细胞提总RNA，取1μlRNA在逆转录酶作用下合成cDNA，然后以此cDNA为模板，以角蛋白引物序列：上游5'-GAGGCATCCAGAACGAGAAGG-3'下游5'-CGGGCATTG TCCACAGTATTTG-3'（扩增片段长223bp），RPE65蛋白引物序列:上游：5'-TTCAACCTCTTCCATCACATCAAC-3'下游：5'-GATTCAAGCCAAGTCCATACGC-3'（扩增片段长397bp），内对照β-肌动蛋白（β-Actin）引物序列：上游：5'-AAAGACCTGTACGCCAACACAG-3'下游：5'-TTTTAGG ATGGCAAGGGACTTC-3'（扩增片段长度：556bp）（由南京金斯瑞生物公司设计并合成）扩增。产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照。

2 结果

2.1 BMSC形态及鉴定结果

原代培养48h有部分细胞贴壁，少数形态呈杆状，4~6d细胞呈杆状或梭形，形成多个不同大小的细胞集落，7~10d呈放射状向外扩展，细胞呈梭形，并逐渐融合成漩涡状单层细胞。传代后细胞分布均匀，形态一致，长梭形，呈成纤维细胞样形态（见图1）。

第3代人BMSCs表面抗原检测显示CD90表达阳性率CD90+/CD34-：96.3%，CD44表达阳性率CD44+/CD34-：94.2%，表明所获得的细胞绝大部分为BMSCs。

2.2 RPE细胞鉴定：RPE65蛋白免疫细胞化学检测结果

第三代RPE细胞呈梭形，融合时可呈多边形，镜下可见胞浆内少量色素颗粒，随着传代的延续色素颗粒逐渐减少。

图2 第三代RPE细胞融合（×100）

图3 免疫细胞化学检测RPE细胞的RPE65蛋白表达情况（免疫细胞化学二步法，DAB染色，苏木素复染，×100）

2.3 诱导第一阶段诱导的BMSCs巢蛋白免疫细胞化学检测结果

诱导第3d开始能检测到巢蛋白表达，第12d阳性表达率达到最高，达（86.9±2.6)%。

图4 免疫细胞化学检测诱导BMSCs巢蛋白表达情况（免疫细胞化学二步法，DAB染色，苏木素复染，×100）

2.4 诱导第一、二阶段后细胞角蛋白及RPE65蛋白的免疫细胞化学检测结果

第一阶段诱导后可检测到角蛋白表达，但未见RPE65蛋白表达；第二阶段诱导后检测到角蛋白阳性率为（60.8±3.1)%，RPE65蛋白表达阳性率为（25.7±3.8)%；

图5 免疫细胞化学检测诱导BMSCs角蛋白表达情况（免疫细胞化学二步法，DAB染色，苏木素复染，×100）

图6 免疫细胞化学检测诱导BMSCs后RPE65蛋白表达情况（免疫细胞化学二步法，DAB染色，苏木素复染，×100）

2.5 诱导第一、二阶段角蛋白及RPE65蛋白的RT-PCR检测结果

实验组第一阶段诱导后RT-PCR检测角蛋白及RPE65蛋白，发现有角蛋白表达，未见明显RPE65蛋白表达；实验组第二阶段诱导后发现角蛋白及RPE65蛋白均有表达；对照组未见角蛋白及RPE65蛋白表达。

图7 两阶段诱导角蛋白的RT-PCR 结果

图8 两阶段诱导RPE65蛋白的RT-PCR 结果

3 讨论

本实验采用分阶段诱导BMSCs向神经外胚层来源的视网膜色素上皮细胞方向分化。干细胞在体内分化与微环境密切相关，不同的发育阶段干细胞所处的微环境不同将会影响干细胞发生不同的分化，干细胞进入新的微环境后,对新的微环境的调节信号做出反应，分化成与新的生长环境相适应的细胞。我们采用分阶段诱导是在细胞分化的不同阶段提供合适的微环境以期向特定细胞分化。第一阶段采用神经细胞生长分化所必须的生长因子诱导BMSCs向神经前体细胞分化，第二阶段将分化成的神经前体细胞与RPE细胞供培养，利用RPE细胞所分泌的相关物质来提供一个微环境，促使诱导的神经前体细胞向RPE样细胞分化。

有实验证实骨髓间充质细胞表面存在PDGF、FGF和EGF受体等。本实验首先使用bFGF、EGF及BDNF三种因子进行诱导BMSCs向神经前体细胞诱导分化。这些因子具有以下的生物学功能：bFGF具有促有丝分裂功能，在神经元发生、分化和功能方面起着重要作用，在体外bFGF能提高视网膜表达视蛋白的水平，体内有神经视网膜保护作用。BDNF能延缓神经元的变性和自然死亡，对神经元的存活和生长具有重要作用，有很强的刺激和促进神经细胞生长、分化的功能；不仅能保护神经元的功能，而且能促进光损伤的视网膜修复；BDNF能明显促进光感受器细胞生存；在发育中的RPE细胞中有BDNF表达。大量实验证实EGF存在于视网膜，可能与胚胎发育期和生后的光感受器细胞的诱导分化有关，它是视网膜神经元有效的分化因子。

RPE细胞能分泌多种生长因子,这些因子是维持视网膜完整结构所必须的，RPE维持光感受器细胞的存活，RPE能分泌FGF（FGF-1, FGF-2, FGF-5），IGF-1,PEDF等。PEDF有神经保护和为抗血管生成功能，提供环境保护，健康眼RPE能分泌PEDF维持视网膜和脉络膜结构，并支持光感受器细胞和神经视网膜细胞的生长[3]。RPE细胞已知的能分泌以上多种因子，还有分泌一些其他未知的营养成分，这些对于RPE细胞的生长是必需的，因此本实验将诱导分化后的神经前体细胞再与RPE细胞共培养，利用RPE细胞分泌的各种因子为神经前体细胞提供一个微环境，以促进其向RPE样细胞方向分化。

本实验采用细胞角蛋白8＆18(CK8＆18)与RPE65蛋白鉴定诱导分化后的细胞。细胞角蛋白是细胞骨架蛋白的一种，见于所有的上皮细胞，细胞角蛋白包括多个亚型，不同的上皮细胞表达不同亚型的细胞角蛋白。RPE细胞表达分子量为45KD的CK18和分子量52KD的CK8。而在视网膜组织，RPE细胞是视网膜中的上皮细胞，其它非上皮细胞不表达细胞角蛋白表面标志。RPE65 基因定位于1p31,编码视网膜色素上皮特异蛋白, RPE65蛋白是RPE细胞特异性蛋白，故而在该组织中表明就是RPE细胞。本实验第一阶段检测角蛋白即有表达，但未见RPE65蛋白表达；第二阶段诱导分化后检测细胞的角蛋白8＆18与RPE65蛋白，均有表达，表明所诱导的部分细胞具有合成角蛋白8＆18与RPE65蛋白的特征。

本实验结果显示在适当的微环境下可以诱导BMSCs分化为表达角蛋白及RPE65蛋白的细胞，但体外的诱导与体内的微环境有着很大的差别，体外诱导分化的细胞是否具有RPE细胞的生理功能如吞噬功能，有序排列，形成紧密连接等仍不明确，这些问题均需要更加深入的研究。

[1] 谢茂松,徐国兴,李琼等.大鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法的比较[J].国际眼科杂志,2007,7（5）:1285-1287.

[2] 徐国兴,杨娟,孙堂胜等.体外原代培养人视网膜色素上皮细胞[J].国际眼科杂志,2004,4（1）:12-15.

[3] Barnstable CJ, Tombran-Tink J. Neuroprotective and antian-giogenic actions of PEDF in the eye: molecular targets and therapeutic potential, Prog. Retin. Eye Res, 2004, 23:561–577.

1.福建省省重点科研课题（基金编号：2008Y0040）。 2.国家卫生部科研基金课题（基金编号：WKJ2008-2-61）。

徐国兴，zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。