刘 尧,周启星,2*,谢秀杰,林大松,荣伟英 (.南开大学环境科学与工程学院,环境污染过程与基准教育部重点实验室/天津市城市生态环境修复与污染防治重点实验室,天津 30007；2.中国科学院沈阳应用生态研究所,中国科学院陆地生态过程重点实验室,辽宁 沈阳 006)

苯、甲苯、乙苯和二甲苯统称 BTEX,属于单环芳香类化合物,易挥发且可溶于水,是原油和石油产品的重要组份,也是一种重要的化工原料.甲苯、乙苯和二甲苯因化工废水排放、污水灌溉或储油罐、输油管的泄露而进入土壤并进一步污染地下水,其对生态环境及人体健康造成严重影响,已引起了人们的广泛重视,并被很多国家列为环境优先污染物[1-3].

近年来,国内外对 BTEX的研究主要集中于人体健康危害性[4]、环境行为[5-6]、降解机理[7]等方面.对BTEX污染环境的修复工作更是目前的研究热点[2,8-10].但关于BTEX对陆生生态系统的生态毒性及其机理的研究较少[11-13],目前国内还没有其对土壤生态系统的急性毒性数据.蚯蚓是评价土壤生态安全性的重要指示生物,其中赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)已被广泛应用于土壤环境污染物的毒性效应研究[14-16].小麦(Triticum aestivum L.)具有易培养、生长周期短的优点,常常被作为模式生物应用于多种污染物的陆生生态毒性研究.种子发芽和根伸长的急性毒性试验可对污染物的危害和生态风险进行诊断及评价[17-19].本实验以赤子爱胜蚓和小麦为研究对象,以甲苯、乙苯和二甲苯(三者简称TEX)为目标化合物,研究其对陆生生物的毒性效应,为这 3种化合物的土壤环境标准的制定提供基础数据和科学依据.

1 材料与方法

1.1 土壤

供试土壤为潮土,采自天津郊区农田,为0～20cm土层样品,土壤样品自然风干,过2mm筛备用.供试土壤理化性质见表1.

表1 供试土壤理化性质Table 1 pHysiochemical properties of the tested soil

1.2 受试生物与试剂

试验生物赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)购于天津贾立明蚯蚓养殖厂.在实验室(20±2)℃、通风良好的暗处培养,以牛粪为食物定期喂食.实验前选取体重在 300～500mg、生殖环带明显、体态相似的健康成蚓为实验个体.小麦(Triticum aestivum L.)购于当地市场,经 H2O2浸泡消毒后使用.试验开始前进行的种子发芽率实验表明发芽率＞95%.

试剂:甲苯、乙苯和二甲苯均为分析纯,购于天津市津东天正精细化学试剂厂.

1.3 污染物溶液配制

甲苯、乙苯和二甲苯不易溶于水,采用助溶剂无水乙醇及乳化剂吐温 80配制污染物溶液,无水乙醇及吐温 80的摩尔分数应不超过0.2%[20-22].移取所需溶剂于具塞玻璃瓶中,依次移入一定量的无水乙醇及吐温80,再移入一定量的蒸馏水配制至所需浓度,混匀后使用.

1.4 蚯蚓毒性试验

蚯蚓急性毒性实验按照An[23]建议的密封土壤微宇宙方法进行.使用内径 2.6cm、高8cm的有底玻璃管为实验容器,针对TEX为挥发性污染物的特点,改良了OECD.207方法.根据预实验中蚯蚓不死及完全死亡的浓度,在二者之间设置正式试验浓度,其中甲苯试验浓度设为300,400,500,600,700mg/kg;乙苯设为150,200,250,300,400mg/kg;二甲苯设为125,150,175,200,250mg/kg.并设置溶剂对照组.称取10g干土样品于玻璃管中,快速且均匀滴入污染物溶液,调整水土比为1:4,迅速用铝箔纸封口.并用封口膜将铝箔纸粘紧在玻璃管壁上,防止污染物挥发.待平衡24h后,快速将土拌匀,每个玻璃管放入1条已清肠24h的蚯蚓,再次封口,将其置于(20±1)℃、湿度为75±1%的生化培养箱中避光培养.每处理重复 10次,分别于24h、48h记录蚯蚓死亡数及中毒症状,蚯蚓对针刺无反应判为死亡.

1.5 小麦种子发芽试验

根据预实验中小麦芽长和根长抑制率10%～60%的浓度,设置正式试验浓度,其中甲苯浓度设为250,500,1000,1500,2000mg/kg;乙苯设为100,200,300,400,500mg/kg;二甲苯设为50,100,200,300,400mg/kg.实验周期为50h,每处理重复3次,并设置溶剂对照组.称取50g干土样品于9cm玻璃培养皿中,快速且均匀加入污染物溶液,使水土比为1:5,迅速用铝箔纸封口,并用封口膜将铝箔纸粘紧在皿壁上,防止污染物挥发.平衡4h后将15粒小麦种子播种于土壤中,再次封口,置于生化培养箱中(25±2)℃黑暗培养.当小麦对照种子初生根达到2～3cm时,终止试验,取出发芽种子,测量根长和芽长.其中,根长是指根和芽接点处到最长根尖的长度;芽长是根基点到芽尖的长度.而且仅当根长和芽长均超过3mm 时,才认为是发芽成功[17].根据对照土壤中种子根和芽伸长值计算添加污染物的土壤中小麦根和芽伸长抑制率.

1.6 数据处理

所有试验数据采用SPSS 13.0和Excel进行处理.小麦毒性试验数据使用平均数±标准误差表示.使用单样本 K-S test检验数据正态分布性质.蚯蚓半数致死浓度LC50及小麦芽、根半数抑制浓度IC50采用单位概率回归分析法得出.

2 结果与分析

2.1 对赤子爱胜蚓的生态毒性

在整个实验过程中,对照组均未出现蚯蚓死亡及不适现象.甲苯、乙苯及二甲苯暴露的中毒症状显示为:低浓度暴露(甲苯浓度＜500mg/kg;乙苯浓度＜250mg/kg;二甲苯浓度＜175mg/kg),蚯蚓身体僵硬,蠕动迟缓,反应迟钝;高浓度暴露(甲苯浓度≥500mg/kg;乙苯浓度≥250mg/kg;二甲苯浓度≥175mg/kg),蚯蚓丧失向土壤深层挖掘的能力,在土壤表层剧烈挣扎,分泌体液,出血、身体断裂甚至死亡.蚯蚓的死亡率随着污染物浓度的升高及暴露时间的延长而增加(图1).

由表2可知,3种污染物暴露情况下,经单样本 K-S检验,蚯蚓的死亡率均属于正态分布(P＞0.05),可以使用单位概率回归分析法进行进一步分析.由图1a可见,当甲苯浓度为300mg/kg时,暴露于土壤中的蚯蚓在24h内无死亡现象,随着暴露时间延长至 48h,蚯蚓不但通过体表接触毒物,还可通过进食土壤与毒物接触,蚯蚓死亡率增至10%.当甲苯浓度为600mg/kg时,24h内蚯蚓死亡率为50%,48h内蚯蚓死亡率骤增至90%,这可能是由于污染物对蚯蚓体表和消化系统的2种毒性作用在一定浓度下达到极限,产生了跃迁式毒性效应[24].蚯蚓暴露于甲苯浓度为700mg/kg的土壤中48h,死亡率为100%.甲苯对蚯蚓的毒性具有明显的剂量-效应相关关系,24h及48h的Pearson相关系数r分别为0.988及0.979.通过单位概率回归分析法计算得到甲苯对蚯蚓的24h及48h半数致死浓度LC50分别为583.6,454.3mg/kg (表2).

图1 甲苯、乙苯、二甲苯对蚯蚓的毒性效应曲线Fig.1 Curves for toxic effects of toluene, ethylbenzene and xylene on the earthworm Eisenia fetida

由图1b可见,当乙苯浓度为150mg/kg时,暴露于污染土壤中的蚯蚓在 24h内无死亡现象,暴露时间延长至48h,蚯蚓死亡率增至 40%.污染物浓度提高至 400mg/kg,蚯蚓 24h死亡率为60%,48h死亡率为100%.乙苯对蚯蚓的毒性也具有较明显的剂量-效应相关关系,24h及 48h的Pearson相关系数r分别为0.980及0.926.通过单位概率回归分析法计算得乙苯对蚯蚓的24h及48h半数致死浓度LC50分别为346.8,167.1mg/kg(表2).

表2 甲苯、乙苯和二甲苯对蚯蚓的毒性效应分析Table2 Toxic effects of toulene, ethylbenzene and xylene on the earthworm Eisenia fetida

由图1c可见,当二甲苯浓度为125mg/kg时,暴露于污染土壤中的蚯蚓在 24h内的死亡率为10%,暴露时间延长至48h,蚯蚓死亡率增至50%.污染物浓度提高至250mg/kg,蚯蚓24h死亡率为70%,48h死亡率为100%.二甲苯对蚯蚓的毒性同样存在明显的剂量-效应相关关系,24h及48h的Pearson相关系数r分别为0.969及0.959.通过单位概率回归分析法计算得到二甲苯对蚯蚓的24h及 48h半数致死浓度 LC50分别为192.4,127.2mg/kg (表2).

因为实验周期较短(48h),可认为污染物主要是通过皮肤接触而对蚯蚓产生毒性,口腔接触产生的毒性是次要的.参考前苏联制定的化学物质急性毒性分级标准[25](表3),可初步判定本实验中甲苯暴露 24h对蚯蚓属中等毒性,暴露时间延长至 48h则属高毒性;乙苯及二甲苯两个时间段暴露对蚯蚓均属高毒性.

表3 化学物质急性毒性分级标准[25]Table 3 The grading criteria for acute toxicity of chemicals[25]

2.2 对小麦幼苗的生态毒性

由图2可见,小麦的芽、根抑制率随着土壤中污染物浓度的增高而变大.3种污染物暴露情况下,经单样本K-S检验,小麦的芽、根抑制率均属于正态分布(P＞0.05),可以使用单位概率回归分析法进行进一步分析.甲苯对小麦的芽、根生长具有明显的剂量-效应相关关系,Pearson相关系数 r分别为0.950,0.962.通过单位概率回归分析法计算得甲苯对小麦芽、根半数抑制浓度IC50分别为1449.6,978.6mg/kg;乙苯对小麦的芽、根生长具有明显的剂量-效应相关关系,Pearson相关系数 r分别为0.972,0.979.通过单位概率回归分析法计算得乙苯对小麦芽、根半数抑制浓度IC50分别为482.4,343.8mg/kg;二甲苯对小麦的芽、根生长具有明显的剂量-效应相关关系,Pearson相关系数r分别为0.986,0.969.通过单位概率回归分析法计算得二甲苯对小麦芽、根半数抑制浓度IC50分别为435.5,197.2mg/kg (见表4).由于当土壤中污染物浓度达到IC50时,植物已受到了严重的影响,一般使用 IC10表示植物受污染物影响的毒性阈值[26],甲苯、乙苯和二甲苯对小麦芽的IC10分别为342.2,195.4,45.9mg/kg,对小麦根的IC10分别为206.7,134.5,26.3mg/kg.甲苯、乙苯和二甲苯污染条件下,小麦种子根长抑制率与芽长抑制率均在0.01水平显著相关,Pearson相关系数r分别为0.993、0.991和0.988.

图2 甲苯、乙苯和二甲苯对小麦的芽、根伸长抑制率的影响Fig.2 Effects of toulene, ethylbenzene and xylene on inhibition rate of wheat shoot and root elongation

3 讨论

对于土壤中的挥发性有机化合物来说,研究其急性毒性效应比其慢性毒性效应更有意义[28],因此在本实验中设置蚯蚓急性毒性实验周期为24h和48h,小麦种子根伸长和芽伸长抑制实验周期为50h.

一般认为,污染物的水溶性越大,其在土壤环境中的生物可利用性越强[27].甲苯、乙苯和二甲苯(总)在水中的溶解度分别为:515,152和160～220mg/L[28].由表2和表4可知,这3种物质对蚯蚓及小麦的急性毒性大小顺序均为二甲苯(总)＞乙苯＞甲苯,二甲苯与乙苯的急性毒性相差不大,甲苯的毒性最小,这与范亚维等[21-22]在研究BTEX对水生生物毒性影响效应时观察到的结果相似.这可能是由3种苯系物辛醇-水分配系数(Kow)不同而引起的.甲苯、乙苯和二甲苯均属于非极性麻醉性化合物,非极性麻醉化合物的毒性体现在其对细胞膜的穿透作用上[29],污染物的Kow越大,就越容易非选择性通过细胞膜进入生物体内而体现毒性.甲苯、乙苯和二甲苯(总)的lgKow分别为:2.69,3.13,3.15～3.20[28],导致二甲苯对土壤生物显现出最大的毒性,其次是乙苯,甲苯虽然有较大的水溶性,但是lgKow是3种物质中最小的,导致显现出的毒性也最小.说明有机污染物的生态毒性不仅与其在水中的溶解度有关,还与其他物理化学性质及其对靶标生物的毒性机制有关[17].

由表4可知,3种污染物对小麦芽、根生长抑制具有明显的剂量-效应相关关系(Pearson相关系数r均在0.01水平显著相关),说明小麦芽长、根长可用于指示土壤被甲苯、乙苯及二甲苯污染的程度,但3种污染物对根的IC10均小于对芽的IC10,说明小麦种子根长对污染物胁迫的响应较芽长更为敏感,这也与Liu等[30]的研究结论相符,在种子的发芽过程中,相对于芽来说,根与污染土壤的接触更加直接.另外由于芽生长需要根从土壤中摄取养分维持,小麦芽长的抑制与根长的抑制有密切关系[30],这也在本实验中得到了验证(2种参数在0.01水平上显著相关).

4 结论

4.1 甲苯、乙苯和二甲苯对蚯蚓的毒性影响具有明显的剂量-效应关系,且随着暴露时间的延长,蚯蚓死亡率增加.参考前苏联制定的化学物质急性毒性分级标准,可初步判定本实验中甲苯暴露 24h对蚯蚓属中等毒性,暴露时间延长至 48h则属高毒性,乙苯及二甲苯两个时间段暴露对蚯蚓均属高毒性.

表4 甲苯、乙苯和二甲苯对小麦的毒性效应分析Table 4 Toxic effects of toulene, ethylbenzene and xylene on wheat Triticum aestivum L.

4.2 甲苯、乙苯和二甲苯对小麦芽、根生长抑制具有明显的剂量-效应关系,小麦芽长、根长均可用于指示土壤被甲苯、乙苯及二甲苯污染的程度,但小麦种子根长对污染物胁迫较芽长更为敏感,根长抑制率与芽长抑制率之间有明显的相关关系.

4.3 甲苯、乙苯和二甲苯对蚯蚓及小麦的急性毒性大小顺序均为二甲苯(总)＞乙苯＞甲苯.

[1]Mater L, Sperb R M, Madureira L A S, et al. Proposal of a sequential treatment methodology for the safe reuse of oil sludge-contaminated soil [J]. Journal of Hazardous Materials,2006,136(3):967-971.

[2]Plaza G A, Wypych J, Berry C, et al. Utilization of monocyclic aromatic hydrocarbons individually and in mixture by bacteria isolated from petroleum-contaminated soil [J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2007,23(4):533-542.

[3]范亚维,周启星. BTEX 的环境行为与生态毒理 [J]. 生态学杂志, 2008,27(4):632-638.

[4]Nakajima T, Wang R S, Elovaara E, et al. Toluene metabolism by cDNA-expressed human hepatic cytochrome P450 [J].Biochemical Pharmacology, 1997,53(3):271-277.

[5]Walden T, Spence L. Risk-based BTEX screening criteria for a groundwater irrigation scenario [J]. Human and Ecological Risk Assessment, 1997,3:699-722.

[6]Atkinson R. Atmospheric chemistry of VOCs and NO(x) [J].Atmospheric Environment, 2000,34(12-14):2063-2101.

[7]Seagren E A, Becker J G. Review of natural attenuation of BTEX and MTBE in groundwater [J]. Practice Periodical of Hazardous,Toxic and Radioactive Waste Management, 2002,6(3):156-172.

[8]Salanitro J P, Dorn P B, Huesemann M H, et al. Crude oil hydrocarbon bioremediation and soil ecotoxicity assessment [J].Environmental Science and Technology, 1997,31(6):1769-1776.

[9]Lovely D R. Potential for anaerobic bioremediation of BTEX in petroleum-contaminated aquifers [J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 1997,18(2-3):75-81.

[10]陈华清,李义连.地下水苯系物污染原位曝气修复模拟研究 [J].中国环境科学, 2010,30(1):46-51.

[11]Dorn P B, Vipond T E, Salanitro J P. Assessment of the acute toxicity of crude oils in soils using earthworms, microtox○R, and plants [J]. Chemosphere, 1998,37(5):845-860.

[12]An Y J. Toxicity of benzene, toluene, ethylbenzene, and xylene(BTEX) mixtures to Sorghum bicolor and Cucumis sativus [J].Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology,2004,72(5):1006-1011.

[13]An Y J, Lee W M. Comparative and combined toxicities of toluene and methyl tert-butyl ether to an Asian earthworm perionyx excavates [J]. Chemosphere, 2008,71(3):407-411.

[14]OECD. Guidelines for the Testing of Chemicals, No.207:Earthworm Acute Toxicity Tests [S]. Paris: OECD, 1984.

[15]Abdul M M, Bouche M B. Earthworm toxicology: from acute to chronic tests [J]. Soil Biology and Biochemistry, 1997,29(3-4):699-703.

[16]梁继东,周启星,孙福红.蚯蚓在环境安全研究中的应用 [J]. 生态学杂志, 2006,25(5):581-586.

[17]范 飞,周启星,王美娥.基于小麦种子发芽和根伸长的麝香酮污染毒性效应 [J]. 应用生态学报, 2008,19(6):1396-1400.

[18]万寅婧,占新华,周立祥.土壤中芘、菲、萘、苯对小麦的生态毒性影响 [J]. 中国环境科学, 2005,25(5):563-566.

[19]Wang M E, Zhou Q X. Single and joint toxicity of chlorimuron-ethyl, cadmium,and copper acting on wheat Triticum aestivum [J]. Ecotoxicology and Environmental safety, 2005,60(2):169-175.

[20]Barbour J P, Smith J A, Chiou C T. Sorption of aromatic organic pollutants to grasses from water [J]. Environmental Science and Technology, 2005,39(21):8369-8373.

[21]范亚维,周启星,王媛媛,等.水体 BTEX 污染对大型溞和霍普水丝蚓的毒性效应及水环境安全评价 [J]. 环境科学学报,2009,29(7):1485-1490.

[22]范亚维,周启星.水体甲苯、乙苯和二甲苯对斑马鱼的毒性效应[J]. 生态毒理学报, 2009,4(1):136-141.

[23]An Y J. Assessing soil ecotoxicity of methyl tert-butyl ether using earthworm bioassay; closed soil microcosm test for volatile organic compounds [J]. Environmental Pollution, 2005,134(2):181-186.

[24]宋玉芳,周启星,许华夏,等.菲、芘、1,2,4-三氯苯对蚯蚓的急性毒性效应 [J]. 农村生态环境, 2003,19(1):36-39.

[25]徐新云.制定统一的“化学物质急性毒性分级标准”之探讨 [J].现代预防医学, 1997,24(2):246-231.

[26]鲍艳宇,周启星,谢秀杰.四环素类抗生素对小麦种子芽与根伸长的影响 [J]. 中国环境科学, 2008,28(6):566-570.

[27]Luo Y, Zang Y, Zhong Y, et al. Toxicological study of two novel pesticides on earthworm Eisenia foetida [J]. Chemosphere,1999,39(13):2347-2356.

[28]Mackay D, Shiu W Y, Ma K C. Physical-Chemical Properties and Environmental Fate Handbook [M]. CRC netBase, Chapman and Hall, 1999.

[29]Di Marzio W, Saenz M E. QSARS for aromatic hydrocarbons at several trophic levels [J]. Environmental Toxicology, 2006,21(2):118-124.

[30]Liu X, Zhang S, Shan X, et al. Toxicity of arsenate and arsenite on germination, seeding growth and amylolytic activity of wheat[J]. Chemosphere,2005,61(2):293-301.