赵文娟,朱建军,吕廷德,薄新文,王新华

(1石河子大学动物科技学院,石河子832000;2新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室,石河子832000)

扩展莫尼茨绦虫DAZ基因的分离和cDNA序列分析

赵文娟1,2,朱建军1,2,吕廷德1,2,薄新文2,王新华2

(1石河子大学动物科技学院,石河子832000;2新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室,石河子832000)

为进一步研究扩展莫尼茨绦虫并以其作为模式生物提供基础。通过构建的扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获取其全长cDNA序列;采用生物信息学等技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较以及蛋白质结构的初步预测。结果显示:获得了1个扩展莫尼茨绦虫新基因 DAZ基因,cDNA全长1905bp,包含1个完整的ORF,编码562个氨基酸,登录号为:GH291478。蛋白理论分子量为61.3169kD,等电点为4.77,不稳定系数50.27,脂肪系数65.04,总平均亲水性-0.472。二级结构预测该蛋白有1个跨膜区域,以无规卷曲(L)为主,没有二硫键结合位点。本研究成功分离扩展莫尼茨绦虫DAZ基因。

扩展莫尼茨绦虫;DAZ基因;序列分析

莫尼茨绦虫、细粒棘球绦虫和日本血吸虫同属于扁形动物门,并且在新疆地区分布广泛,有良好的材料来源。因此,利用莫尼茨绦虫来研究对人类危害更大的人畜共患的寄生虫病,可以有效的减少实验过程中对实验人员的危害。莫尼茨绦虫有发达的生殖系统,每一成熟的节片内有两套成熟的生殖系统[1],以莫尼茨绦虫为模式生物来研究其他生物甚至人类生殖疾病的发生与治疗,成为当前科研工作者的重要研究课题。

无精症缺失基因(deleted in azoospermia gene,DA Z)定位于 Y染色体长臂无精症因子c区 (azoospermia factor c,AZFc),在大多数个体中有4种拷贝 ,分别被命名为 DAZ1、DAZ2、DAZ3 和 DAZ4[2]。有研究表明,DA Z基因在睾丸组织中特异表达,其产物为RNA结合蛋白,可能在生精过程中发挥着重要作用[3]。DA Z基因的全部拷贝缺失已被普遍认为是生精障碍的重要遗传病因。近年来,有文献报道,DA Z部分拷贝缺失的某些类型也与人类的生精障碍有关[4,5]。

本文从扩展莫尼茨绦虫克隆得到 DA Z基因,通过序列分析了解此基因在绦虫的理化性质,寻找保守序列,以期为利用其作为模式基因研究其他物种的相关疾病奠定分子基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 扩展莫尼茨绦虫cDNA文库

由新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室构建。该文库采用smart cDNA技术构建,以冻干质粒形式保存。其包装效率为1.01×106pf u/mL,插入片段平均长度为1.39kb左右,重组率在94.7%以上。

1.1.2 载体及宿主菌

载体:pBluescript II SK＊,可用于 DNA的表达;宿主菌:大肠埃希菌DH5α。

1.1.3 引物

测通全长用通用引物 M13和特定引物 5′-CCAACGTTA TGA TCTGCACC-3′。所有引物均由上海生工有限公司合成

1.2 方法

1.2.1 cDNA文库的转化及筛选

将大肠杆菌DH5α接种于LB培养基中,37℃,220r/min振摇培养2h后,用 CaCl2制备感受态细胞。加入2μL原文库,混匀,冰浴 30min,42℃热休克90s,立即冰浴 2min,加LB培养基 800μL,37℃120r/min振摇 1h,13000r/min离心 30s,去上清。将沉淀涂布于含100μg/mL氨苄青霉素、200mg/L IPTG、20mg/L X-gal的固体LB琼脂培养基中铺板,37℃培养过夜。

1.2.2 阳性克隆的分离及测序

挑取单个白色菌落,用 X-gal再次筛选后并扩增,用天根质粒DNA纯化试剂盒提取质粒。于ABI377型自动测序仪上进行DNA序列测定(由上海生工有限公司协助完成)。

1.2.3 新基因的获取与序列分析

将上述原始测序结果进行拼接后,在线进行Blast分析,得到扩展莫尼茨绦虫新的 EST并登录GenBank。根据EST分析结果分配克隆重叠群,分析与拼接克隆重叠群,对拼接后的序列用 Primer 5.0软件设计步移法测序引物。

用上述测序引物进行测序直至出现PolyA,将原始测序结果进行编辑后获得新基因的全长cDNA序列。通过 NCBI网站(http://www.ncbi nih.nlm.gov/blast X)与其他物种的同源蛋白序列进行比对分析,利用DNAMAN进行多序列联配和种系进化树分析;利用开放阅读框探寻器(ORF finder)确定其完整编码序列并显示其编码的氨基酸序列。

用蛋白分析专家系统服务器 Ex PASy Proteomics Server(http://ca.expasy.org/)所提供的蛋白质在线分析工具,如protparam(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)预测氨基酸序列的相对分子质量、等电点、稳定性指数等理化性质,Inter Pro Scan (http://www.ebi.ae.uk/Inter-Pro Sean/)和Motif Scan(http://myhits.isb-sbi.ch/cgi-bin/motif_scan)预测氨基酸序列中的基序(motif)和功能域;用 Predict Protein (http://cubic.bloc.columbia.edu/predictprotein/)预测氨基酸序列的跨膜区和拓扑结构以及二级结构、用 SWISSMODEL(http://swiss-model.expasy.org/)进行二级结构基础上的三级结构同源建模,预测蛋白质的空间构象。

2 结果与分析

2.1 DAZ基因的cDNA序列

该基因cDNA全长1905bp,包含1个完整的ORF,从142bp到1830bp的位置,编码562个氨基酸,终止密码子 TAA出现于1827bp处,3′端含有polyA尾(图1)属于RRM超家族。

图1 DAZ基因的cDNA序列Fig.1 cDNA sequence of DAZ gene

2.2 蛋白序列比对

将扩展莫尼茨绦虫DAZ基因的蛋白序列和NCBI数据库里的蛋白进行比对,选取日本血吸虫(Schistosoma japonicum),日本三角涡虫(Dugesia japonica)、斑马鱼(Danio rerio)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、牛(Bos taurus)、大西洋鲑(Salmo Salar)、鸡(Gallus gallus)、人类(Homosapiens)、黑脚硬蜱 (Ixodes scapularis),爪蟾(Xenopus(Silurana)tropicalis)、小白鼠 (Mus musculus)、扩展莫尼茨绦虫(Moniezia expansa)的基因进行蛋白序列比对(图2)。

在14～21和121～125的位置存在明显的保守区域,各物种都为稳定的表达,蛋白比对的一致性为45.75%。

2.3 蛋白理化特性

扩展莫尼茨绦虫该蛋白理论分子量为61.3169 kD,等电点为4.77,不稳定系数50.27,大于阈值40则性质不稳定,脂肪系数65.04,总平均亲水性-0.472(图3),蛋白总体疏水性较高。含有10个半胱氨酸,假设全部形成二硫键时,280nm处的摩尔消光系数为53455(mol·cm)-1,0.1%浓度(1g/L)的吸光度(A280)为0.872;假设二硫键全部打开时,280nm处的摩尔消光系数为52830(mol·cm)-1,0.1%浓度(1g/L)的吸光度(A280)为0.862。在酵母和大肠埃希菌中表达的半衰期分别大于20h和10h,在哺乳动物网状细胞体外培养中表达的半衰期为30h。

图2 DAZ基因的氨基酸多重序列比对Fig.2 Amino acid multiple sequence alignment of DAZ gene

图3 DAZ基因的亲水性预测Fig.3 Hydrophilicity prediction of DAZ gene

2.4 DAZ基因结构的特征性序列、蛋白质的拓扑结构和二级结构

通过Motif Scan(http://myhits.isb-sbi.ch/cgi-bin/motif_scan)在线预测DAZ基因有4个N-糖基化位点,分别位于碱基的:45～48,404～407,507～510,554～557位;1个氨基葡聚糖附着位点位于碱基的51～54位;5个蛋白激酶C磷酸化位点,分别位于碱基的:47～49,69～71,112～114,474～476,529～531位;12个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,分别位于碱基的:2～5,188～191,194～197,208～211,237～240,248～251,468～471,474～477,508～511,512～514,523～526,534～537位;1个酪氨酸激酶磷酸化位点位于碱基的531～538位;10个N-十四(烷)酰化位点,分别位于碱基的:6～11,16～21,199～204,225～230,244～249,279～284,254～259,460～465,479～484,555～560位;1个推定的真核核糖核蛋白(RNP)标记的RNA结合区位于碱基的138～145位。Htm预测该蛋白有1个跨膜区域(图4),位于碱基的265～288位;Sec预测α螺旋(H)、β折叠(E)和无规卷曲(L)的比例分别为15.48∶12.46∶72.06,二级结构以无规卷曲(L)为主,没有二硫键结合位点。

图4 DAZ基因的跨膜区域预测Fig.4 Trans membrane region prediction of DAZ gene

2.4.5 DAZ基因的三级结构建模

DA Z基因三级结构建模如图5所示,模型的构建从5～175aa,和其他蛋白的序列最高一致性达到32%,Evalue值为2.9E-22。

图5 DAZ基因三级结构预测Fig.5 Tertiary structure prediction of DAZ gene

3 讨论

扩展莫尼茨绦虫DA Z基因在线比对分析属于RRM超家族,与精子的发育、雄性的生殖有关。同其他物种DA Z基因进行氨基酸多重序列比对时,在14～21和121～125的位置存在明显的保守区域,各物种都为稳定的表达,蛋白比对的一致性为45.75%。这为我们利用扩展莫尼茨绦虫生殖器官作为模式来研究其它物种相同器官的发育和病变机理提供了基础。目前男性不育症是医学界关注的重要问题之一,大约有10～15%的已婚夫妇不能生育,其原因多种多样,其中精子质量和无精子症基因(Deleted in Azoospermia,DA Z)是 2个重要因素[6]。而且也有文献报道 DAZ基因与男性不育相关,它主要调控早期生殖细胞的增殖。DA Z基因簇完全或部分缺失可导致10%不育男性的生殖细胞减少[7]。DA Z基因家族所有成员只在生殖细胞表达[8],但是具体的表达机制还不清楚,我们对扩展莫尼茨绦虫 DA Z基因的研究可以为研究人类DA Z基因提供模式生物方面的资料。

随着辅助生育技术的发展与ICSI技术的日益成熟,使严重生精障碍不育患者也能生育后代。可以预见,在接受 ICSI的夫妇中,越来越多的严重寡精症患者将被作为精子供体,而研究已表明,精子供体的异常遗传物质可能传递给下一代[9,10],所以寻找有效方法检测严重寡精症患者将是一项关系后代的严峻任务。但是从研究材料和伦理道德方面看我们不可能直接用人来进行试验,必须选择一类来源方便并且基因同源性较高的模式生物进行研究。我们通过对扩展莫尼茨绦虫 DA Z基因进行序列,发现其与人类的 DA Z基因有高度的同源性,存在稳定的保守序列。对扩展莫尼茨绦虫DA Z基因的分析和功能预测,更具有了现实的意义。

扩展莫尼茨绦虫该蛋白理论分子量为61.3169 kDa,等电点为4.77,不稳定系数50.27,脂肪系数65.04,总平均亲水性-0.472,蛋白总体疏水性较高而且很不稳定。4个N-糖基化位点,5个蛋白激酶C磷酸化位点,12个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点,10个N-十四(烷)酰化位点,1个推定的真核核糖核蛋白(RNP)标记的RNA结合区。Htm预测该蛋白有1个跨膜区域,Sec预测α螺旋(H)、β折叠(E)和无规卷曲(L)的比例分别为15.48∶12.46∶72.06,二级结构以无规卷曲(L)为主。没有二硫键结合位点,三级结构建模对DA Z基因的空间构型进行了形象的预测。这些蛋白功能位点和结构预测不但说明该条基因有多个功能位点,而且为后续研究 DAZ基因的功能域结构指明了方向。

我们在本实验中得到的 DA Z基因,通过和其他物种DA Z基因的蛋白序列比对发现了几个稳定表达的保守序列。DA Z是激活精子生成和保持种族 Y染色体功能的重要基因,我们可以利用扩展莫尼茨绦虫发达的生殖系统作为模式生物研究其他物种的生殖疾病。以上结果表明,我们成功获得了扩展莫尼茨绦虫 DA Z基因的全长cDNA序列,并对其cDNA序列和编码蛋白进行B生物信息学分析,从而为该基因功能的实验性鉴定工作奠定了基础。

[1]孔繁瑶.家畜寄生虫学·第2版[M].北京:中国农业出版社,2004.

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The Isolation and Sequence Analysis of the cDNA Encoding Moniezia expansa Deleted in Azoospermia

ZHAO Wenjuan1,2,ZHU Jianjun1,2,LÜTingde1,2,BO Xinwen2,WANG Xinhua2
(1 College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi 832003,China;2 Key Laboratory of Sheep Breeding&Biotechnology of XPCC,Shihezi 832000,China)

To provide a foundation for further research even as model organisms,clones were selected randomly from the cDNA library and sequenced by using the method of expression sequence tags(ESTs).Novel genes were acquired by primer-walking.By using bioinformatics,the cDNA sequence encoding M.expansa deleted in azoospermia(DAZ)was analyzed,including searching the ORF,translating the nucleotide to protein sequence,searching similarity and predicting of initial protein structure.The results showed that an new gene of M.expansa-DA Z gene obtained:the full-length of cDNA was 1905bp,a complete ORF encoding 562 amino acids,accession number was GH291478.The academic pIwas 4.77 and molecular weight was 61.3169kDa,instability index:50.27,aliphatic index:65.04,grand average of hydropathicity:-0.472.The conclusion is that:DA Z gene was successfully separated from M.ex pansa.

M.expansa;deleted in azoospermia;sequence analysis

S858

A

1007-7383(2010)01-0037-06

2009-04-19

国家重点基础研究发展计划前期研究专项(2006CB708512)

赵文娟(1983-),女,硕士生,专业方向为分子寄生虫学;e-mail:zwj-130@163.com。

薄新文(1969-),男,研究员,从事寄生虫分子生物学研究;e-mail:boxinwen@yahoo.com.cn。