王丽丽 王向东 田 哲 刘婉玉 叶永姣

(四川大学建筑与环境学院,四川成都,610065)

利用制酒废水产生生物絮凝剂MFHJ4的研究

王丽丽 王向东 田 哲 刘婉玉 叶永姣

(四川大学建筑与环境学院,四川成都,610065)

以制酒废水作为替代培养基对HJ4菌株进行培养,考察了营养和环境条件对絮凝剂合成的影响,提取剂种类、提取剂加入量、上清液p H值等对絮凝剂提取效率的影响。结果表明,复合型生物絮凝剂MFHJ4的最佳合成条件为:COD浓度为12000mg/L,以硫酸铵为氮源,C∶N=20∶1,初始p H值为4.5,培养温度为30℃,摇床转速为150r/min,培养时间为24h;该絮凝剂的最佳提取条件为:HJ4菌株发酵培养24h后对离心上清液进行浓缩,在浓缩液中加入3倍体积无水乙醇进行提取,MFHJ4的产量为3.85g/L。

制酒废水培养基 生物絮凝剂 提取方法 絮凝活性

微生物絮凝剂是由微生物产生的具有生物活性的大分子物质,具有良好的絮凝沉淀性能。近年来微生物絮凝剂因具有可生物降解且无二次污染等特点而受到广泛关注[1,2]。但到目前为止,生物絮凝剂在实际生产中尚未得到推广应用,生产成本过高一直成为阻碍其推广的主要原因。

笔者利用廉价的制酒废水培养基对 HJ4菌株进行发酵培养,并对絮凝剂的研制条件进行优化考察,如优化培养条件、提取方法等,以降低生物絮凝剂的生产成本。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用水

制酒废水:取自成都某酒厂,其水质参数:COD为 90525 mg/L,还原糖为 14200mg/L,总磷为648.4mg/L,总氮为1691.3mg/L,p H值为3.26。

印染废水:取自成都市某印染厂,废水颜色为蓝灰色。水质参数:COD为857.5mg/L,p H值为7.5-8.5,色度为610倍,浊度为416.03度。

1.1.2 试验用菌种及培养基

试验用菌种:试验所用的复合型絮凝剂产生菌HJ4为成都市某污水处理厂二沉池活性污泥中分离获得两株酵母菌混合而成,并由本实验室保藏。

制酒废水培养基:对制酒废水按照不同的倍数稀释,并依据C∶N∶P值添加营养物质,在121℃下高温灭菌30min后备用。

1.1.3 高岭土悬浊液

称取1g高岭土(160目)放入1 L水中,充分搅匀并静置90 min后吸取上清液,该上清液即为所需的高岭土悬浊液。

1.2 试验方法

1.2.1 絮凝活性测定

于250mL烧杯中加入高岭土悬浊液93 mL,1%CaCl2溶液5 mL,发酵液或 2.5g/L MFHJ4溶液2mL,用1mol/L的 NaOH溶液或 1mol/L的HCl溶液将p H值调至7.0左右。用电动搅拌器快搅(250r/min)30s,再慢搅(70r/min)5min,静置15min后,吸取上清液于550 nm处测定其吸光度(B),以加蒸馏水的样品作对照,550 nm处测定吸光度(A)。絮凝活性计算式如下:

絮凝率(%)=(A-B)/A×100%

1.2.2 培养条件的优化

(1)COD浓度对絮凝效果的影响:分别将废水培养液的 COD浓度调至 6000、9000、12000、15000mg/L,在氮源为硫酸铵、C∶N∶P值为100∶5∶1的条件下连续培养36h,取样测其絮凝活性。

(2)外加氮源种类对絮凝效果的影响:分别采用氯化铵、硝酸铵、尿素、硫酸铵作为外加氮源,在废水培养液COD浓度为12000mg/L,C∶N∶P值为100∶5∶1的条件下连续培养36h,取样测其絮凝活性。

(3)C∶N值对絮凝效果的影响:分别将废水培养液的 C∶N 值调至5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1,在废水培养液的 COD浓度为12000mg/L,氮源为硫酸铵的条件下连续培养36h,取样测其絮凝活性。

(4)p H值对絮凝效果的影响:分别将废水培养液的 p H 值调至 3、3.5、4、4.5、5,在废水培养液的COD浓度为12000mg/L,氮源为硫酸铵,C∶N∶P值为100∶5∶1的条件下连续培养36h,取样测其絮凝活性。

(5)絮凝剂合成周期的确定:在废水培养液的COD浓度为12000mg/L,氮源为硫酸铵,C∶N∶P值为100∶5∶1的条件下连续培养,每隔6h取样测定菌体浓度和絮凝活性。

1.2.3 絮凝活性分布

将发酵液在3000rpm的转速下离心30min,得到上清液和菌体(用蒸馏水洗涤后悬浮在与上清液等体积的蒸馏水中),分别取发酵液、上清液和菌体测定其絮凝活性大小。

1.2.4 MFHJ4的提取工艺

在MFHJ4絮凝剂最优合成条件下进行发酵培养,将发酵液4000rpm离心30min后,取上清液进行减压蒸发至原体积的1/10,在浓缩液中加入一定体积预冷提取剂,混匀后在4℃下静置过夜;析出沉淀物以3000rpm离心10min收集棉絮状沉淀物,沉淀物用无水乙醇洗两次,最后使用无水乙醇将沉淀洗入圆底烧瓶,利用旋转蒸发仪进行干燥,即得灰白色粉末状絮凝剂粗制品,记为MFHJ4。

1.2.5 提取工艺条件的确定

(1)提取剂种类的确定:分别采用无水乙醇、丙酮和无水乙醚作为提取剂,在提取剂加入量为上清液体积的2倍,沉淀物在60℃下烘干4h的条件下进行提取,测其产量和絮凝活性。

(2)乙醇加入量的确定:在乙醇加入量分别为上清液体积的1、2、3、4倍的条件下进行提取,测其产量和絮凝活性。

(3)上清液p H值的确定:在上清液p H值分别为 5、6、7、8、9,乙醇加入量为上清液体积的 3 倍的条件下进行提取,测其产量和絮凝活性。

2 结果与讨论

2.1 培养条件的优化

2.1.1 COD浓度的影响

复合型生物絮凝剂产生菌 HJ4在不同COD浓度的废水发酵培养液中培养后,对高岭土悬浊液的絮凝效果见图1。

图1 培养基COD浓度对HJ4混合菌合成絮凝剂影响

从图1可见,当COD浓度为120000mg/L时,絮凝率最大,达到87.11%。增大或减小COD浓度,絮凝活性均降低。这是因为当 COD浓度过高时,微生物的生长将受到抑制,而COD浓度太低会导致碳源不足,影响微生物絮凝剂的合成,也会降低絮凝效果[3]。

2.1.2 氮源种类的影响

氮源为微生物合成蛋白质和核酸等物质的原料,对微生物絮凝剂的合成同样有重要的影响。HJ4菌株在不同氮源下的絮凝效果见图2。

图2 氮源种类对絮凝剂合成的影响

由图2可见,混合菌 HJ4利用硫酸铵、硝酸铵和硫酸铵作为氮源时,絮凝率均可达到70%以上,其中以硫酸铵做氮源时絮凝活性最高,而以尿素作为氮源时絮凝效率较低,仅为31.90%。目前见诸报道的大部分生物絮凝剂产菌,大多利用有机氮或有机氮与无机氮的复合进行絮凝剂合成,仅以无机化合物做氮源生产MBF的报道较少[4]。本研究中仅以硫酸铵作为氮源,就可以使发酵液的絮凝活性达到90%以上,可能是因为发酵液中加入硫酸铵后,微生物可以直接吸收、利用NH4+进行生长代谢和絮凝剂的合成;另一方面,制酒废水为以粮食为原料经微生物发酵后产生,其中含有大量脂肪酸、无机盐和生长因子等对产絮菌株生长具有促进作用的物质,因此不需要再补充有机氮。

2.1.3 C∶N值的影响

有研究表明,适宜的碳氮比有助于菌体生长以及胞外分泌物的形成[5]。HJ4菌株在不同碳氮比下的絮凝效果见图3。由图3可看出,HJ4混合菌合成絮凝剂的最佳碳氮比为20,高于或低于此值都会使絮凝活性显著下降。这可能是因为碳氮比较低时(＜20),培养基氮源充足,微生物的代谢重心转为菌体的生长,不利于絮凝剂的积累;碳氮比高于20时,培养基中的氮源相对较少不利于混合菌的生长和繁殖,同样不利于絮凝剂的合成;而在碳氮比为20时,有利于HJ4混合菌的菌体生长和絮凝剂合成。

图3 培养基C∶N对絮凝剂合成的影响

2.1.4 p H值的影响

培养基的p H值可影响微生物细胞表面的带电状态、有机物的离子化程度和发酵液的氧化还原电位,从而影响菌体对营养物质的吸收及菌体自身代谢酶和产絮凝剂酶的活性。HJ4菌株在不同p H值下的絮凝效果见图4。

由图4可以看出,在发酵培养基初始p H值为3到5的范围内,发酵液的絮凝活性均可达到70%以上,当p H值到4.5时发酵液絮凝活性迅速增长,可达到90%左右。一般酵母菌生长的最佳p H值范围是4.5～6[6],p H值高于或低于此范围均会影响菌体的生长和代谢产物的积累。对于 HJ4混合菌,初始p H值为4.5时,菌体生长和絮凝剂合成均处在最佳p H值范围内,因此其絮凝活性可达到90%以上。

图4 培养基初始p H值对 HJ4混合菌合成絮凝剂的影响

2.1.5 絮凝剂合成周期的确定

为了确定MFHJ4絮凝剂的合成周期以及絮凝剂合成和菌体生长的关系,本试验在上述最佳条件下进行 HJ4混合菌的发酵培养,同时测定培养过程中菌体浓度、发酵液絮凝活性,结果见图5。

图5 HJ4产絮凝剂周期曲线

由图5可知,接种 HJ4混合菌后发酵培养基既具有一定的絮凝活性,并在0～24小时的培养中,絮凝活性迅速增加,24h时发酵液絮凝活性达到90.44%;之后随着培养时间延长,发酵液絮凝活性变化不大,基本趋于稳定。混合菌菌体的生长有类似趋势,在0～24h内菌体数量迅速增加,菌体生长进入对数期,24h后进入稳定期,菌体浓度基本保持不变。

由上面的变化趋势可以看出,HJ4混合菌絮凝剂的合成和菌体的生长是同步进行的,并在稳定期絮凝活性达到最大,说明发酵液中的絮凝剂是由微生物细胞合成并分泌到胞外,而并非在菌体自溶后才释放进入培养基的。

2.2 絮凝活性分布

不同絮凝剂产生菌合成的絮凝剂在发酵液中的分布是不同的,有的附着于细胞表面,有的游离于发酵液中,有的在细胞内积累,只有当菌体细胞自溶后才能释放进入发酵液。为了解絮凝剂产生菌 HJ4的活性分布情况,分别测定了发酵液及其离心后的上清液和菌体的絮凝活性,结果见图6。

由图6可知,HJ4混合菌发酵培养24h后絮凝活性物质主要存在于上清液中,MFHJ4是利用HJ4混合菌的代谢产物。而细胞悬浮液絮凝效果较低,表明 HJ4混合菌产生的絮凝活性物质大部分分泌至胞外发酵液中,这为生物絮凝剂的提取提供了方便。

图6 HJ4絮凝活性分布

2.3 提取条件的确定

2.3.1 不同提取剂的影响

采用2倍体积提取剂对离心发酵上清液进行沉淀,不同提取剂对絮凝剂MFHJ4的提取效果见表1。

结果表明:用乙醇和丙酮均可快速从发酵上清液中沉淀出棉絮状、黄白色絮凝剂。丙酮提取的产量略高于无水乙醇(多0.03g/L),但丙酮属于低毒性化学试剂,对人体健康有一定的危害,并且丙酮(分析纯)的价格是无水乙醇的两倍多,用于大量提取成本较高。下面的试验选用无水乙醇作为提取剂。

表1 不同提取剂对MFHJ4产量的影响

2.3.2 无水乙醇加入量的影响

离心发酵上清液分别在无水乙醇加入体积为1-4倍下进行沉淀,无水乙醇不同加入量的提取效果见图7。

图7 无水乙醇不同加入量对MFHJ4凝剂提取效果的对比

由图可知,无水乙醇加入量对MFHJ4絮凝剂产量有极大影响:随着无水乙醇加入量增加,絮凝剂产量迅速提高,并在加入量为浓缩液体积三倍时,MFHJ4产量达到3g/L以上。但对产品品质影响较小,4种加入量下制得的产品絮凝活性都在90%左右,活性较高,说明使用无水乙醇提取MFHJ4是通过降低其在溶液中的溶解度而使其沉淀析出,并不会改变其分子结构。综合考虑,下面的试验选择无水乙醇用量3倍体积。

2.3.3 p H值的影响

为了确定p H值对MFHJ4提取的影响,将浓缩后的上清液用稀 HCl和稀NaOH溶液调节p H值到不同值,在无水乙醇加入量为三倍体积的条件下进行提取。结果见图8。

图8 浓缩液的p H值对MFHJ4絮凝剂提取的影响

由图可知,在酸性条件下,随着p H值的升高,MFHJ4的产量和絮凝活性迅速升高,当p H值达到7以后,产量和絮凝活性增加并不明显。MFHJ4的产量随着p H值的升高而升高,可能会导致MFHJ4中带负电的功能基团(羧基、羟基等)浓度的增加,从而使MFHJ4表面负电荷增多,最终影响了MFHJ4的特性。发酵上清液的p H值在7-8的范围内,因此提取过程不需要调节p H值。

3 结论

(1)复合型生物絮凝剂产生菌 HJ4利用制酒废水作为替代培养基的适合培养条件是:培养基COD浓度为12000mg/l,氮源为硫酸铵,C:N=20:1,初始p H值为4.5,相对接种量15%,培养温度温度为30℃,摇床转速150 r/min,培养时间为24h。所得絮凝剂对高岭土悬浊液的絮凝率为90.44%。

(2)絮凝剂MFHJ4提取条件简单,在无水乙醇加入量为上清液体积的3倍,4℃下冷藏过夜,采用旋转蒸发仪干燥,每升发酵液可获得絮凝剂3.85g。

(3)本试验以制酒废水作为替代培养基制取的絮凝剂产率高,具有较高的絮凝活性,对环境不会造成二次污染,具有广阔的应用前景。

[1]马放,刘俊良,李淑更,等.复合型微生物絮凝剂的开发[J].中国给水排水,2003,19(4):1-4.

[2]关毅,张娟.EM复合菌群产絮凝剂的絮凝性能[J].水处理技术,2006,32(7):42-45.

[3]刘晖,周康群,胡勇有,等.青霉菌 HHE-P7利用酱油废水产生微生物絮凝剂的研究[J].环境污染治理技术与设备,2006,7(3):40-44.

[4]Zhong Li,Shan Zhong,Heng-yi Lei,eatl.Production of a novel bioflocculant by Bacillus licheniformis X14 and its application to low temperature drinking water treatment.Bioresource Technology.2009,100:3650-3656.

[5]Salehizadeh H,Shojaosadati S A.Extracellular biopoly-meric flocculants―Recent trends and biotechnological importance[J].Biotechnol Adv,2001,19(5):371-385.

[6]沈萍.微生物学.北京:高等教育出版社.2000.

Preparation of Composite Bioflocculant MFHJ4 by Alcohol Wastewater

WangLili,WangXiangdong,TianZhe,LiuWanyu,YeYongjiao
(SchoolofArchitectureandEnvironmentalEngineering,SichuanUniversity,Chengdu,610065)

Strain HJ4 was cultured in alcohol wastewater,and the impact of nutrition and environmental conditions for the production of MBF and types of extractants、p H of concentrated liquid etc.for the extraction of MBF were investigated.The results showed that the optimum conditions for the production of MFHJ4 were asfollows:COD of the alcohol wastewater was 12000mg/L,(NH4)2SO4as nitrogen source,C∶N 20∶1,initial p H 4.5,the temperature 30℃and shaking speed 150rpm;Impact of variousfactors on the best extraction conditions:HJ4 cultured for 24h,concentrated liquid natural p H using ethanol as extracting reagent,ethanol dosage is 3 times the volume of concentrated liquid,and application of this method of p urification-extraction yield reached 3.85g/L.

alcohol wastewater medium;microbial bioflocculant;extraction process;flocculating activity