马铃薯茎段快繁及试管薯诱导

2009-11-29长江大学园艺园林学院湖北荆州434025

长江大学学报(自科版) 2009年5期

刘华，姚振 (长江大学园艺园林学院，湖北荆州 434025)

马铃薯茎段快繁及试管薯诱导

刘华，姚振 (长江大学园艺园林学院，湖北荆州 434025)

在马铃薯(Solanumtuberosum)的茎段快繁中，采用生根时间、生根率、节间长度和粗度作为评估马铃薯茎段快繁壮苗的标准。结果表明，以MS为基本培养基，添加40 mg/L 的B9处理马铃薯茎段快繁效果最好；黑暗处理20 d，并在培养基中添加B9能够提高试管薯诱导的效果。

马铃薯(Solanumtuberosum)；茎段快繁；试管薯

马铃薯(SolanumtuberosumL.)属茄科茄属植物，在生长期间容易受病毒侵染，病毒一旦侵入，表现出各种各样的退化类型。在生产中，主要是利用茎尖分生组织的脱毒培养，提高马铃薯的产量和品质[1，2]。

马铃薯茎段快繁、培育壮苗和诱导试管薯是马铃薯脱毒生产的重要的环节，这些环节的研究对于优化整个茎尖脱毒体系有重要的意义。有研究表明，B9和CCC对培育壮苗有作用[3～5]，此外，光照对诱导试管薯具有影响[6]。本研究采用脱毒苗的生根时间、生根率、节间长度和粗度作为评估壮苗的标准，探讨B9和CCC对茎段快繁和培育壮苗的影响，并研究采用2种不同的光照处理结合高浓度的B9来诱导试管薯的效果。

1 材料与方法

1.1 外植体的获得和接种

选择生长健壮、无病虫害的马铃薯块茎于沙盘中催芽，保持其湿润状态，15 d后取芽作为外植体。将茎段置于75%的酒精中消毒30 s，再用0.1%的升汞消毒15 min，最后用无菌水清洗3 ～ 4次，解剖镜下切取茎尖放入培养基MS + 1.0 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA中培养。

1.2 愈伤组织的继代培养和分化

将茎尖在28 ℃下进行培养，约40 ～ 60 d可形成愈伤组织。此时所形成的愈伤组织较小，在培养基MS + 4.0 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA中进行继代培养并分化。

1.3 茎段快繁及壮苗培养

将分化的脱毒小苗切成小段，每段带一个叶片，插入茎段快繁培养基，培养基分别添加B9和CCC，B9浓度为20、40、60 mg/L，CCC浓度为0.1、0.5、1.0 mg/L，以 MS培养基作为对照。每个处理至少60个茎段，记录茎段在不同的培养基中的生长状况，包括生根时间、茎段恢复生长时间、20 d后的生根率、茎节间的长度和粗度，并进行统计分析。

1.4 试管薯的诱导

将培养的壮苗剪切成段，每段带2 ～ 3个叶片，叶片向上插入添加含有不同B9浓度的MS培养基中，将所有的苗放在14 h光照10 h黑暗的光周期环境中处理一周，一周后进行光照处理。B9为3个水平(200、350、500 mg/L)，光照处理为2个水平(光照14 h/黑暗10 h光周期培养，黑暗处理20 d后转入光照14 h/黑暗10 h培养)，每个处理至少120个茎段。观察记录试管薯诱导期间各个处理的试管薯诱导率，并进行统计分析。

培养基琼脂的质量分数为0.8%，pH5.8，高压灭菌。

2 结果与分析

2.1 茎段快繁和壮苗培养

(1) 生根时间和恢复生长时间从图1可以看出，马铃薯茎段在添加CCC时开始生根时间较短，而添加B9的生根时间都较长。在B9浓度为40 mg/L时其开始生根时间最长，平均为7.6 d。CCC的生根时间都较短，在CCC为0.5 mg/L的生根时间最长，平均6.2 d，0.1 mg/L CCC和1.0 mg/L CCC时的开始生根时间较短，分别为5.4和4.4 d。1.0 mg/L CCC在整个处理中其开始生根时间最短。从茎段恢复生长时间来看，各个处理的恢复生长时间相差不大。

图1 茎段在不同培养基下的生根时间和恢复生长时间Figure 1 Time of rooting and recovery growth of shoot cuttings on different media

(2) 生根率从表1可以看出，MS培养基添加40 mg/L B9以及1.0 mg/L CCC时的生根率最高，达到95%以上。B9浓度上升到60 mg/L时，生根率显著下降，生根率为34.88%。生根率随着CCC浓度的升高而升高。在不添加任何激素的MS培养基中的生根率为56.73%，不添加任何激素可以使茎段苗生根，只是所需要用的时间较长。

在整个培育壮苗和茎段快繁中，生根时间较短的处理其生根率也最高，1.0 mg/L CCC的开始生根时间平均为4.4 d，20 d的生根率为95.95%。

表1 不同的培养基对茎段的生根率和节间长度与粗度的影响Table 1 The effect of different media on rooting frequency and coarseness and Length of internode for shoot cuttings

注：邓肯氏显著性检验，不同大、小写字母分别表示在0.01、0.05水平上存在显著性差异

(3) 试管苗节间长度和粗度对于脱毒苗的大规模生产需要选择较粗壮的试管苗，节间越粗，苗越壮，越容易成活。当培育的试管苗可以移栽的时候，测定试管苗第二节间的粗度和长度。从表1可以看出，添加20 mg/L B9的节间粗度为0.095 9 cm，在所有处理中节间粗度最粗。随着B9浓度的升高，节间粗度变小。添加0.1 mg/L CCC的节间粗度为0.073 6 cm，节间粗度随着CCC浓度的升高而变小。从表1还可以看出，20 mg/L B9的节间长度并不是最短的。此外，随着CCC浓度的升高，节间长度越长，苗生长状况也不好。

添加1.0 mg/L CCC的开始生根时间最短，生根率也较高，但是苗生长情况不是最好，苗的节间长，且苗较细弱，效果最好为添加0.5 mg/L 的CCC。从B9处理来看，B9为40 mg/L的生根率最高，但以20 mg/L B9的开始生根的时间最短，苗也较粗壮。综合来看，添加40 mg/L B9的效果最好。

2.2 试管薯的诱导

图2 光照处理和B9浓度对结薯率的影响Figure 2 The effect of light treatment with concentration of B9 on frequency of tuberization

从图2中可以看出，在相同的光照条件下随着B9浓度的升高，结薯率下降，在光周期条件培养的200 mg/L B9的结薯率为48%，当B9浓度达到500 mg/L时的结薯率为12%。在黑暗状态下200 mg/L B9的结薯率为70%，比光照状态下的结薯率高22%。黑暗状态下的结薯率明显高于光照状态下的结薯率。因此黑暗状态处理200 mg/L B9的诱导试管薯的效果最好。在不含任何激素的培养基MS培养基中，也可以诱导试管薯只是所需要的时间较长。在整个处理中，还没有出现试管薯之前，所有处理的苗都出现矮化状态，而且苗非常粗壮，这可能因为B9浓度过高的原因造成。

3 讨论

目前马铃薯脱毒产业中脱毒苗试管快繁是重要的环节。马铃薯脱毒试管苗生长较其他组培植物容易，是组织培养中的模式植物[7]。影响试管苗生长的因素很多，在22 ℃、光强为2 000 ～ 3 000 lx、每日16 h光照条件下生长使试管苗处最佳温、光条件，在马铃薯脱毒产业中已达到共识。培养基成分直接影响试管苗的生长，无机盐、有机物、铁盐使植株生长旺盛，叶片肥厚、根系健壮；激素和生长调节剂可控制植株根、茎、叶生长的方向。

谢光新等[4]发现在MS液体培养基中加入不同浓度的矮壮素时，发现MS + 1.0 mg/L CCC的效果最好，培养出的脱毒苗长势好、节间短，是进行切段繁殖的良好培养基。而陈芝兰等[5]在茎段快繁中采用了不同浓度的B9，发现20 mg/L B9其节间较短，且苗较粗壮；刘尚前[8]也发现20 mg/L B9对培养壮苗有很好的影响。此外有报道表明，在培养基中加入抗生素具有抑菌、杀菌和改善脱毒苗根系生长的作用[9]。在本研究中主要是采用用B9和CCC进行培养壮苗，试验中以40 mg/L B9处理最好，平均生根率为96.25%，脱毒苗在培养基中生长较好。相对于其他几个处理，40 mg/L B9的苗比较粗壮。从这个结果来看，虽然有的处理生根率很高，例如MS + 1.0 mg/L CCC的生根率很高，但是试管苗比较细弱。如果单独采用1 ～ 2个标准如生根率，来评价添加激素培育壮苗的效果，是不准确的。综合4个评价因子来看，应当选择以MS + 40 mg/L B9培育壮苗，这样效果最好。

马铃薯试管薯的形成和发育受多种因素影响，当外部环境适宜时，没有任何激素也能形成小薯，但是含有诱导结薯激素的培养基结薯晚、结薯率高，因此添加一定种类和改变外源激素对试管薯诱导非常必要。张昌伟等[10]认为6-BA对试管薯的诱导有很大的促进作用。韦莹[11]认为添加香豆素浓度为25 mg/L诱导试管薯形成作用最显著，效果最好，结薯率达81.25%。罗丽萍等[12]认为提高总薯重和平均薯重最优组合是MS + 5 mg/L B9+ 黑暗；提高薯数的最优组合是B5 +5 mg/L B9+ 黑暗培养。陈芝兰[5]在诱导试管薯中发现以MS + 5 mg/L 6-BA + 200 mg/L B9的试管薯结试管薯结的最好，且降低成本。

Dobranszki[6]提出了光照对诱导试管薯的影响，并提出在短日照处理时期内高的光照强度处理要比其他光照处理试管薯产生的早，高的光照强度能够缩短试管薯开始生长的时间，但是这种影响还与光周期处理和基因型有关。在诱导完成以后，块茎开始生长时期，高的光照强度影响不大。刘玲玲[13]也提出了全黑暗处理可以提高试管薯的结薯率。

本研究中，主要是采用B9结合光照处理，诱导试管薯。结果发现所有的黑暗处理都比光周期处理的结薯率高，结薯率最高的组合为MS添加200 mg/L B9，黑暗处理20 d，结薯率为70%。但是在研究中，用B9处理的脱毒苗在前期都停止生长，苗非常矮小粗壮，这可能是因为B9的浓度过高所致。同时给研究带来了一个好处，就是在诱导试管薯的过程中可以使用用100 mL的三角瓶进行诱导，而不必采用500 mL大号三角瓶，这样可以提高效率并降低成本。

[1]Luis F Salazar(阎文昭，张勇飞译)．马铃薯病毒及其防治[M]．北京：中国农业科技出版社，2001．183～184．

[2]胡琳．植物脱毒技术[M]．北京：中国农业大学出版社，2000.111～112．

[3]祁彦丰，王萃莲．用三种不同水质配制培养基对马铃落脱毒试管苗的影响[J]．中国马铃薯，2000，14(l)：173．

[4]谢光新，周恒．马铃薯茎尖脱毒及微型薯生产技术研究[J]．安徽农业科学，2005，33(6)：965～966．

[5]陈芝兰，奕运芳，次柏，等．马铃薯茎尖脱毒快繁及试管薯生产技术[J]．西藏农业科技，1999，21(1)：34～39．

[6]Dobranszki J. Effects of light on in vitro tuberization of potato of pureSolanumtuberosumorigin [J]. Acta Biologica Hungarica, 2001, 52：137～147.

[7]司怀军，王蒂．我国马铃薯组织和细胞培荞研究进展[J]．中国马铃薯，2000，14(4)：220～223．

[8]刘尚前，袁丁，张凤英，等．马铃薯试管薯诱导影响因子的研究[J]．安徽农业科学，2007，35(21)：6383～6384．

[9]方志明．加入抗生素培养基对马铃薯试管苗的影响[J]．中国马铃薯，2001，15 (2)：92．

[10]张昌伟，侯喜林，袁建玉，等．不同外源激素对马铃薯试管薯形成的影响[J]．中国马铃薯，2001，15(5)：271～273．

[11]韦莹．马铃薯组织培养及试管薯形成的研究[D]．南宁：广西大学，2007．

[12]罗丽萍，杨柏云，蔡奇英．马铃薯试管微型薯诱导的研究[J]．南昌大学学报(理科版)，2002，26(4)：372～374．