龙可 薛耀明 沙建平 桑丹 林占

波动性葡萄糖对胰岛β细胞INS-1的影响

龙可 薛耀明 沙建平 桑丹 林占

目的探讨波动性葡萄糖对培养的胰岛β细胞株INS-1细胞的损伤机制。方法实验分5组。对照组:葡萄糖浓度为5.5 mmol/L；持续高糖组：葡萄糖浓度为16.7 mmol/L；波动性高糖组：16.7 mmo/L葡萄糖培养2 h 后更换葡萄糖浓度为5.5 mmo/L，继续培养3 h，每天重复3 次,夜间9 h维持在5.5 mmo/L葡萄糖的培养基中；N-乙酰半胱氨酸(NAC，1.0 mmo/L)+高糖组；NAC+波动性高糖组。流式细胞仪检测活性氧簇(ROS)的水平；四氮唑蓝定量检测细胞内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)的活性；同时检测还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的含量。结果干预72 h后，对照组、高糖组、波动性高糖组、NAC+高糖组和NAC+波动性高糖组细胞的ROS活性分别为37.77±2.31、86.97±7.97、124.27±10.04、60.92±2.61和51.47±3.36；G6PD活性分别为1.25±0.03、1.09±0.02、1.03±0.01、1.12±0.02和1.21±0.01；NADPH含量分别为(0.123±0.003)mmol/mg prot、(0.112±0.004)mmol/mg prot、(0.099±0.002)mmol/mg prot、(0.116±0.005)mmol/mg prot和(0.120±0.002)mmol/mg prot。波动性高糖组细胞ROS活性较单纯高糖组显著增加(Plt;0.01)，G6PD活性和NADPH含量较单纯高糖组显著减少(Plt;0.01)；加NAC共孵育使细胞的变化程度减小。结论波动性高浓度葡萄糖使培养的INS-1细胞氧化应激水平增高，其机制可能是由于抗氧化酶G6PD活性降低导致了氧化还原的失衡。

胰腺β细胞； 活性氧； 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶； 波动性高糖

随着人们对糖尿病发病机制研究的不断深入,高糖引起的氧化应激在糖尿病发生发展中的作用备受关注[1]。与其他组织细胞相比,胰岛细胞内抗氧化物酶水平较低[2]，这使其更容易受到氧化应激攻击。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)是细胞内关键的抗氧化酶，它通过调节还原型辅酶Ⅱ(NADPH)来维持细胞内抗氧化物质水平，协调细胞内氧化还原的平衡。而氧化应激归根结底即细胞内活性氧簇(ROS)的产生增多和(或)抗氧化酶的减少。最近研究表明,血糖波动比持续高血糖对糖尿病并发症危害可能更严重。本实验通过波动性葡萄糖处理培养的胰岛β细胞,观察波动性葡萄糖对β细胞的影响，探讨其机制。

材料和方法

一、实验分组及处理

大鼠胰岛细胞瘤细胞株INS-1购自武汉大学细胞库，置RPM I1640的完全培养基(含10 mmol/L Hepes,1 mmol/L 丙酮酸钠,50 μmol/L β-巯基乙醇,100 U/ml青霉素和100 μg/ml的链霉素)常规培养，消化收集细胞，调整细胞浓度至1×106/ml。6孔培养板中每孔加入1 ml细胞悬液，分5个实验组。对照组：葡萄糖浓度为5.5 mmol/L；持续高糖组：葡萄糖浓度为16.7 mmol/L；波动性高糖组：16.7 mmo/L葡萄糖培养2 h后更换葡萄糖浓度为5.5 mmo/L，继续培养3 h，每天重复3 次,夜间9 h维持在5.5 mmo/L葡萄糖培养基中[3]；N-乙酰半胱氨酸(NAC，1.0 mmo/L)+高糖组；NAC+波动性高糖组。每组设3个复孔，共干预72 h。

二、检测指标

1．ROS测定：采用荧光探针DCFH-DA测定法。按照ROS检测试剂盒说明书操作。取1 ml细胞悬液(gt;104)上流式细胞仪检测，激发波长488 nm，发射波长525 nm，计算平均荧光强度(MFI)。

2．G6PD活性检测：取1 ml细胞悬液(gt;106)至冻存管中，置液氮冷冻后37℃水浴融化，重复3次，每次间隔10 min。最后将液体转移至1.5 ml EP管，4℃ 12 000 g离心5 min，取上清，采用四氮唑蓝定量测定法检测G6PD活性。

3．NADPH含量测定：按照文献[4]的方法检测，单位为mmol/mg prot。

三、统计学方法

结 果

一、细胞内ROS的变化

对照组、高糖组、波动性高糖组、NAC+高糖组和NAC+波动性高糖组细胞的ROS分别为37.77±2.31、86.97±7.97、124.27±10.04、60.92±2.61和51.47±3.36，高糖组和波动性高糖组均较对照组明显增高(Plt;0.01)，同时波动性高糖组又显著高于高糖组(Plt;0.01)。NAC+波动性高糖组较单纯波动性高糖组显著减少(Plt;0.01)，但仍高于对照组(Plt;0.01，图1)。

图1 各组INS-1细胞内ROS的荧光强度图

二、G6PD和NADPH的变化

对照组、高糖组、波动性高糖组、NAC+高糖组和NAC+波动性高糖组细胞的G6PD活性分别为1.25±0.03、1.09±0.02、1.03±0.01、1.12±0.02和1.21±0.01；NADPH含量分别为(0.123±0.003)mmol/mg prot、(0.112±0.004)mmol/mg prot、(0.099±0.002)mmol/mg prot、(0.116±0.005)mmol/mg prot和(0.120±0.002)mmol/mg prot。高糖组和波动性高糖组G6PD及NADPH含量明显低于对照组(Plt;0.01)，波动性高糖组又低于高糖组(Plt;0.01)，而NAC+波动性高糖组较单纯波动性高糖组显著增加(Plt;0.01)。

讨 论

长期高糖引起的氧化应激可对多种细胞造成损伤。越来越多的证据表明,糖尿病引起的氧化应激是导致糖尿病及其并发症的最根本原因。氧化应激的重要指标之一是ROS的大量增多。ROS是在体内有氧代谢过程中产生的，是由氧激发的化学性质十分活泼的分子,包括氧自由基和非自由基的含氧产物。过量的ROS会打破机体正常氧化、还原动态平衡，造成生物大分子的氧化损伤，干扰正常生命活动，即处于氧化应激状态[5]。

高血糖主要有两种形式，即持续性高血糖和波动性高血糖[4]。目前许多研究都开始关注血糖波动对细胞的影响[6]。然而血糖波动对胰岛β细胞毒害的研究，目前国内外研究较少。本实验结果显示，与正常对照组相比，波动高浓度葡萄糖组和高糖组细胞较对照组细胞产生更多的ROS，提示波动高糖和高糖均可引起细胞氧化应激的损伤，而且前者的损伤更甚。

氧化应激的出现更准确地说是由于细胞内氧化、抗氧化酶水平的失调。氧化和抗氧化作用失衡所致的氧化应激引起胰岛β细胞损伤是糖尿病发生、发展的一个重要机制[7]。与其他组织细胞相比,胰岛细胞内抗氧化物酶水平较低[2]，因而,在一些因素的诱导下,更容易发生氧化应激反应。葡萄糖6-磷酸脱氢酶(G6PD)是细胞内关键的抗氧化酶。它通过调节细胞内主要的还原当量NADPH含量，对抗氧化应激造成的损伤，并且延缓细胞的衰老[8]，因此其重要性越来越受到研究者的关注。Pandolfi等[9]通过敲除细胞G6PD基因的实验证实，G6PD敲除的细胞与内源性G6PD水平正常的细胞相比，其对氧化应激更加敏感、存活率及克隆效率降低。本实验显示，高糖组和波动性高糖组INS-1细胞内G6PD的活性较对照组明显下降，同时ROS增多，且波动性高糖组的变化更为显著。提示波动的葡萄糖可能通过影响细胞内抗氧化酶G6PD的活性，导致ROS的增多，从而加速细胞氧化应激的损伤。

NAC是抗氧化剂，本实验在高糖刺激INS-1细胞的同时加用NAC，结果细胞产生的ROS量显著减少，G6PD活性和NADPH含量明显增加，提示使用抗氧化剂干预，对β细胞的损伤可起到一定的保护作用。因此在临床控制血糖的方面，除控制代谢紊乱,降低高血糖外,更应该坚持平稳降糖措施。

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[2] Tanaka Y,Tran PO,Harmon J,et al.A role for glutathione peroxidase inprotecting pancreatic beta cells against oxidative stress in a model of glucose toxicity.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99:12363-12368.

[3] Polhill TS,Saad S,Poronnik P,et al.Short-term peaks in glucose promote renal fibrogenesis independently of total glucose exposure.Am J Physiol Renal Physiol,2004，287:F268-273.

[4] Prato SD.Inserch of normoglycemia in diabetes:controlling postprandial glucose.Int J Obesity,2002,26(Suppl 3):S9217.

[5] Evans JL,Goldfine ID,Maddux BA,et al.Oxidative stress and stress-activated signaling pathways: a unifying hypothesis of type 2 diabetes.Endocr Rev,2002，23:599-622.

[6] Piconi L,Quagliaro L,Da Ros R,et al.Intermittent high glucose enhances ICAM-1,VCAM21,E-selectin and interleukin-6 expression in human umbilical endothelial cells in culture：the role of poly (ADP-ribose) polymerase.J Thromb Haemost,2004,2:1453-1459.

[7] Bonnefont Rousselot D,Bastard JP,Jaudon MC,et al.Consequences of the diabetic status on the oxidant/antioxidant balance.Diabetes Metab，2000,26:163-176.

[8] Chandrasena LG,De Silva LD,De Silva KI,et al.Changes in erythrocyte glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) and reduced glutathione (GSH) activities in the development of senile and diabetic cataracts.Southeast Asian J Trop Med Public Health,2008,39:731-736.

[9] Pandolfi PP,Sonati F,Rivi R,et al.Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD):G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress.EMBO J,1995,14:5209-5215.

2008-10-23)

(本文编辑：吕芳萍)

Effectoffluctuanthighglucosetopancreaticβ-CelllinesINS-1

LONGKe,XUEYao-ming,SHAJian-ping,SONGDan,LINZhan.

DepartmentofEndocrinologyandMetabolism,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China

XUEYao-ming,Email:yaomingnf@yahoo.com

ObjectiveTo investigate the damage mechanism of fluctuant high glucose on the INS-1 cells (pancreatic β-cell lines).MethodsThe cells were divided into five groups: the control groups (A group: 5.5 mmol/L of glucose), the continuing high glucose group (B group:16.7 mmol/L of glucose), the fluctuant glucose group (C group: 16.7 mmol/L of glucose for cultivation for 2 h, then the concentration changed to 5.5 mmol/L for cultivation for 3 h, which was repeated 3 times per day; the cells were kept in the medium containing 5.5 mmol/L of glucose during night time for 9 h), the continuing high glucose plus NAC (1.0 mmo/L) group (D group), the fluctuant glucose plus NAC group (E group). The intracellular reactive oxygen species (ROS) was observed by the flow cytometry. The activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) was estimated by the tetrazolium linked cytochemical method.Results72 h after intervention, the levels of ROS were 37.77± 2.31, 86.97±7.97, 124.27±10.04, 60.92±2.61 and 51.47±3.36, respectively, in A～E group; the activities of G6PD were 1.25±0.03, 1.09±0.02, 1.03±0.01, 1.12±0.02 and 1.21± 0.01, respectively; the levels of NADPH were (0.123±0.003)mmol/mg prot, (0.112±0.004)mmol/mg prot, (0.099±0.002)mmol/mg prot, (0.116±0.005)mmol/mg prot and (0.120±0.002)mmol/mg prot, respectively. The level of ROS in the cells of the fluctuant glucose group were significantly higher than that in the continuing high glucose group (Plt;0.01). The G6PD activity and NADPH was significantly lower in fluctuant high glucose group than those in the continuing high glucose group (Plt; 0.01). NAC co-cultivation decreased the extent of cell′s change.ConclusionsExposure of INS-1 to high glucose lead to increased oxidative stress, possible mechanism included decreased G6PD activity and subsequent imbalance between oxidation and reduction.

Insulin-secreting cells; Reactive oxygen species; Glucose-6-phosphate dehydrogenase; Fluctuanting high glucose

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.02.014

510515 广州，南方医科大学南方医院内分泌代谢科

薛耀明，Email: yaomingnf@yahoo.com