满晓华 赵航 徐克群 龚燕芳 高军 杜奕奇 许爱芳 李兆申

L-精氨酸诱导实验性慢性胰腺炎大鼠模型的可行性分析

满晓华 赵航 徐克群 龚燕芳 高军 杜奕奇 许爱芳 李兆申

目的初步探讨L-精氨酸诱导慢性胰腺炎大鼠动物模型的可行性。方法将实验动物按完全随机法分为对照组及精氨酸12、24 h和7 d组，每组10只，间隔1 h分两次腹腔内注射L-精氨酸溶液造模。造模后相应时间点检测血淀粉酶、血糖水平，对胰腺组织进行病理评分，Van Gieson法对胰腺胶原纤维染色。结果对照组及精氨酸12、24 h和7 d组的血淀粉酶水平分别为(1 634±890)U/L、(3 872±2 676)U/L、(3 307±2 197 )U/L 和(1 561±304)U/L，精氨酸7 d组血淀粉酶水平显著低于12 h和24 h组(Plt;0.05)，恢复到对照组水平。各组间血糖水平无明显差异。对照组及精氨酸12、24 h和7 d组胰腺的病理分值分别为0.8±0.4、5.1±2.6、6.5±2.2和4.5±1.6，精氨酸7 d组胰腺病理评分显著低于24 h组(Plt;0.05)，但仍显著高于对照组(Plt;0.05)。精氨酸7 d组胶原染色范围明显增加，其他各组未见明显胶原染色。结论L-精氨酸腹腔注射后7 d可引起胰腺组织纤维化及管状复合结构增生，可用于探索慢性胰腺炎大鼠模型。

胰腺炎，慢性； 精氨酸； 模型，动物； 大鼠

L-精氨酸腹腔注射可以成功诱导急性胰腺炎动物模型，以往没有研究尝试应用精氨酸诱导慢性胰腺炎(chronic pancreatitic, CP)。我们前期实验发现，精氨酸注射后7 d，大鼠胰腺组织显著萎缩，被肉芽组织增生取代，同时伴有导管增生和浆细胞浸润。本项研究就精氨酸诱导CP大鼠模型的可行性进行分析。

材料和方法

一、实验动物及分组

健康雄性Sprague-Dwley(SD)大鼠，体重250～300 g，SPF级，由第二军医大学实验动物中心提供。在室温20～28℃、相对湿度40%～70%的动物房内适应性喂养1周后开始实验，实验前12 h起禁食，不控制饮水。

按完全随机法将大鼠分为对照组及胰腺炎12、24 h和7 d组，每组10只。将L-精氨酸粉剂溶于生理盐水配制成20%溶液，调节pH值至7.6～7.8。在剑突下3 cm中线位置进针，注射20% L-精氨酸溶液1 ml/100 g体重，间隔1 h后，重复注射1次。注射后大鼠禁食，可自由饮水，观察大鼠一般情况。在相应时间点处死各组大鼠，获取血液、胰腺、肺脏标本。对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水。

二、血淀粉酶、血糖检测

采用HITACHI-7150型自动生化分析仪测定。

三、胰腺组织病理检查及胶原染色

取胰头部胰腺组织2～3块，常规标本固定、石蜡包埋、切片、HE染色，按照Schmidt等[1]标准从胰腺水肿、坏死、出血和炎细胞浸润4个方面进行评分。同时，应用Van Gieson法进行胶原纤维染色。

四、统计学处理

实验数据应用统计软件SPSS13.0进行分析，计量资料采用t检验及方差分析，并进行正态分布验证，样本率比较采用χ2检验，取α=0.05为临界值。

结 果

一、血淀粉酶、血糖的变化

对照组及精氨酸12、24 h和7 d组的血淀粉酶水平分别为(1 634±890)U/L、(3 872±2 676)U/L、(3 307±2 197 )U/L和(1 561±304)U/L。精氨酸7 d组的血淀粉酶水平显著低于精氨酸12 h和24 h组(Plt;0.05)，恢复到对照组水平。对照组及精氨酸12、24 h和7 d组血糖水平分别为(6.5±1.7)mmol/L、(5.2±1.5)mmol/L、(5.0±1.1)mmol/L和(6.3±2.2)mmol/L，各组间无明显差异(Pgt;0.05)。

二、胰腺病理改变

对照组胰腺大体呈粉红色，组织柔软，胰胆管清晰可见。光镜下见胰腺组织结构清晰，腺泡小叶完整，间质无渗出；精氨酸12、24 h组大鼠可有少到中量腹水，腹水混浊，呈灰黄色或暗红色。胰腺大体可见明显充血、水肿、出血，部分大鼠可见黄白色钙皂斑。光镜下见12 h组胰腺间质内大量炎细胞浸润，散在分布的坏死胰腺腺泡细胞及出血，腺泡实质内见红细胞及中性粒细胞浸润。24 h组胰腺组织损伤更加严重，腺泡结构明显破坏，大片坏死组织，大量炎细胞浸润，间质脂肪组织内可见出血、坏死；精氨酸7 d组胰腺组织体积明显减小，光镜下见肉芽组织增生，充血，水肿，急、慢性浆细胞浸润，小导管增生，腺泡数量明显减少(图1)。对照组、精氨酸12、24 h和7 d组胰腺的病理分值分别为0.8±0.4、5.1±2.6、6.5±2.2和4.5±1.6，精氨酸7 d组胰腺病理评分显著低于精氨酸24 h组(Plt;0.05)，但仍显著高于对照组(Plt;0.05)。

三、胰腺胶原染色

对照组几乎无胶原染色。精氨酸12、24 h组胰腺有少许胶原染色，主要位于小血管分布区域，小叶间隙及实质中无胶原染色。精氨酸7 d组胶原染色范围明显增加，包括增生的小导管区域，在小叶间隔及胰腺实质内也可以见到明显的网状红色胶原染色(图1)。

讨 论

图1对照组(A)、精氨酸12 h组(B)、精氨酸7 d组(C)胰腺病理(上)及胶原染色图(下) (HE、Van Gieson染色 ×100)

简便易行且重复性好的CP动物模型是进行CP相关动物实验研究的必要条件，也是众多研究者努力寻求的目标。迄今为止，已经采用的造模方法包括三硝基苯磺酸胰管内注射法、胆总管远端结扎法、油酸胰管内注射法、二氯二丁基静脉注射法、雨蛙素注射法、乙醇灌注法等[2-4]。这些造模方法模拟人类CP发病因素某个或多个环节，能够制作出类似CP病理表现的动物模型，部分造模方法被认为其诱导CP发病，符合CP发病过程，可以用于探讨CP发病机制和相关病理生理变化。然而，上述方法普遍造模周期较长，部分方法操作相对困难，稳定性不佳。精氨酸法通常用于急性胰腺炎模型制作，我们在实验中发现，应用精氨酸法制作急性胰腺炎模型的大鼠，在造模后第7天，胰腺腺泡组织高度萎缩，伴有小导管增生，管状复合结构形成，符合CP组织损伤病理特点，因而试图探索精氨酸制作CP模型的可行性。本研究结果显示，精氨酸注射后7 d，胰腺原有腺胞组织严重破坏，被肉芽组织增生取代，充血，水肿，急慢性浆细胞浸润，小导管增生，腺泡明显减少，并且血淀粉酶水平显著低于精氨酸12、24 h组，胶原含量较精氨酸12、24 h组显著增多。

胰腺组织纤维化是CP的主要病理特征之一，是由于细胞外基质合成和降解失衡引起。L-精氨酸导致急性胰腺炎的机制目前尚未阐明，有人推测氨基酸失衡参与其发生，另外有研究证实L-精氨酸诱导急性胰腺炎过程中，有细胞骨架结构改变，氧自由基、NO和炎性介质参与其中，并且存在内质网应激[5]。各个因素发生先后顺序及何为始动因素尚不知晓，在其共同作用下，胰腺腺泡细胞在较短时间内大量破坏，同时伴有大量炎细胞浸润。本实验证实，在随后1周时间内，胰腺小导管增生，胰腺实质内发生纤维化改变，血淀粉酶含量降低，在一定程度上符合CP病理改变。精氨酸7 d组的病理切片上显示胰岛组织数量减少，但其血淀粉酶和血糖水平与对照组均无明显差异，与人类CP临床表现仍有少许差异。我们设想，适当延长精氨酸造模时间，或添加辅助诱导剂可能进一步完善该模型方法。

[1] Schmidt J,Rattner DW,Lewandrowski K,et al.A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy.Ann Surg,1992,215:44-56.

[2] 王兴鹏,龚自华,吴恺,等.三硝基苯磺酸诱导大鼠慢性胰腺炎模型的建立.中华病理学杂志,2003,32:267-269.

[3] 寇毅，李延青，孟敏，等.胆源性慢性胰腺炎动物模型建立初步研究.中华消化杂志,2006,26:31-34.

[4] 何新红，陆建平，廖专，等.二丁基二氯化物尾静脉注射建立大鼠慢性胰腺炎模型.胰腺病学,2007,7:17-20.

[5] Dawra R,Sharif R,Phillips P,et al.Development of a new mouse model of acute pancreatitis induced by administration of L-arginine.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2007,292:G1009-1018.

2008-06-30)

(本文编辑：屠振兴)

FeasibilitystudyofinductionofexperimentalchronicpancreatitiswithL-arginine

MANXiao-hua,ZHAOHang,XUKe-qun,GONGYan-fang,GAOJun,DUYi-qi,XUAi-fang,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LIZhao-shen,Email:zhsli@81890.net

ObjectiveTo investigate the feasibility of induction of experimental chronic pancreatitis rat model with L-arginine.MethodsAnimals were randomly divided into control group, arginine 12 h group, arginine 24 h group and arginine 7 d group with 10 rats in each group. L-arginine solution was intraperitoneally injected twice with an interval of 1 h. Serum amylase and glucose levels at corresponding time points were detected and histopathological scores of pancreas were evaluated. Collagen in pancreas was stained with Van Gieson method.ResultsSerum amylase levels were (1 634±890)U/L, (3 872±2 676)U/L, (3 307±2 197)U/L and (1 561±304)U/L in control group, arginine 12 h group, arginine 24 h group and arginine 7 d group, respectively. The serum amylase level in arginine 7 d group was significantly lower than those in arginine 12 h group and arginine 24 h group (Plt;0.05). There was no significant difference in serum glucose level among all the groups. Histopathological scores were 0.8±0.4, 5.1±2.6, 6.5±2.2 and 4.5±1.6, respectively. The histopathological score of arginine 7 d group was significantly lower than those in arginine 24 h group (Plt;0.05). Obvious collagen could be found in pancreatic parenchyma in arginine 7 d group, while little collagen was found in pancreatic tissue in control, arginine 12 h and arginine 24 h groups.ConclusionsInjection of L-arginine induced fibrosis in pancreatic parenchyma and proliferation of tubular complex 7 days later, and it could be used for chronic pancreatitis model induction.

Pancreatitis, chronic; Arginine; Animal, model; Rat

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.02.011

200433 上海，第二军医大学附属长海医院消化内科(赵航现在上海交通大学附属第一人民医院消化内科)

共同第一作者：赵航

李兆申，Email: zhsli@81890.net