柳爱春　刘　超　徐晓丹　孔世佳

摘要对一种快速检测水产品中己烯雌酚残留量ELISA方法进行试验分析,结果表明:在0.15~9.00ng/mL浓度范围内,回归方程y=-13.141Ln(x)+43.52,相关系数R2=0.994 8;相对平均偏差为3.0%~11.6%;回收率为73%~96%;样品检测下限为0.075ng/g;定量下限为0.25ng/g;操作过程简单,检测成本低,检测时间短,因而该方法适用于大批量水产品中己烯雌酚残留量快速检测。

关键词水产品;己烯雌酚;ELISA;快速检测

中图分类号 S912 文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)15-0347-01

己烯雌酚(Diethylstilbestrol,DES)是一种人工合成的雌性激素,应用于水产养殖中能够促进蛋白质同化,提高饲料转化率,同时促进鱼虾类生长。但因其在水产动物中代谢较慢且作用顽强,极小的残留都会对人体生理功能产生影响,主要危害是扰乱人体激素平衡,并具有致癌性,现已被禁止应用于水产养殖中,规定水产品中不得检出己烯雌酚[1]。为此,从2002年开始我国要求水产品中己烯雌酚残留量的检出限为0.6 μg/kg,欧盟要求以2μg/kg为阳性下限。目前,己烯雌酚常用的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)和酶联免疫法(ELISA),但是HPLC法[2]在检出限上不能满足要求;ELISA法[3]是目前水产品中DES残留检测的标准方法,但也存在样品处理过程复杂、检测时间长、成本高等不足。为了寻求一种经济、简便、灵敏、特异性强的测定方法,笔者对一种快速检测水产品中己烯雌酚残留量的ELISA方法进行试验分析,现将结果报告如下。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

Lab system MK3型酶标仪、METTLER PB602-N电子天平、N- EVAP氮吹仪、LRH-150S恒温培养箱、移液器(10μL、20μL、100μL和1mL各1支)、多道移液器(50~300μL)。

美国Bioo MaxSignalTM己烯雌酚ELISA试剂盒、乙酸乙酯、正己烷、无水CaCl2。

1.2测定方法

1.2.1预处理。虾、蟹、甲鱼和淡水鱼取肌肉部分,用匀浆器对样品进行匀浆。

1.2.2提取。称取3.00g匀浆样品(每个样品称2份),加入9mL乙酸乙酯,0.3g无水CaCl2,最大速度振荡3min;20℃,6 000rpm离心5min;移取6mL上清液到另一新的试管,氮气吹干。

1.2.3净化。加入2mL正己烷溶解样品;加入1mL1×PBS-甲醇(3∶2,V/V),漩涡振荡2min;20℃,6 000rpm离心10min,除去上层正己烷层,部分蟹样再次加入正己烷重新净化1次,取50μL下层溶液进行检测。

1.2.4质控。取不同批次的南美白对虾和中华绒螯蟹样品,以20ng/mL的标准溶液分别添加3个不同的浓度水平测试回收率,同时做空白。提取、净化过程同1.2.2和1.2.3。

1.2.5ELISA反应测试步骤。将Bioo试剂盒从冷藏箱取出,并回温至室温。按说明书稀释抗体、洗液和PBS;根据样品数量确定所需的微孔板数,设计好标准品、质控和样品的排布(每个浓度的标准品和每份处理后待测溶液均设平行双孔);分别加入50μL标准品和样品于所设定的孔中;在每孔中加入100μL一抗,混匀1min;室温(20~25℃)孵育30min;洗板3次,每次加入250μL1×洗液,最后一次将板尽量甩干并在吸水纸上吸干;每孔加入150μL二抗;室温避光孵育30 min;洗板3次,每次加入250μL 1×洗液;加入100μL的TMB底物,轻敲微孔板边缘混匀1min;在室温下培养15min,加入100μL的终止液终止反应,在450nm下读OD值。

2结果与分析

2.1线性范围

分别计算标准、质控和样品的平均吸光度值和相对吸光度值:相对吸光度值(%)=(标准或样品吸光度值/零标准吸光度值)×100;以相对吸光度值为纵坐标,标准浓度为横坐标建立标准曲线(见图1)。

2.2精密度和回收率

从标准曲线上读取质控和样品的浓度值,计算南美白对虾和湖蟹样品的精密度和回收率(见表1、表2)。

2.3检测限

从图1可知,0.15~9.00ng/mL浓度范围内,标准曲线线性关系良好,因此根据标准曲线范围内最低浓度0.15ng/mL,计算样品检测下限=0.15ng/mL×1mL×6mL/(4mL×3g)=0.075 ng/g;根据标准曲线范围内次低浓度为0.5ng/mL,计算样品定量下限=0.5ng/mL×1mL×6mL/(4mL×3g)=0.25ng/g。

2.42种方法检测DES比较

2种方法检测DES的成本、时间比较见表3。

3结论与讨论

通过以上试验可知,快速检测水产品中己烯雌酚的方法在检测限、定量范围、精密度、回收率(73%~96%>70%)等技术指标上都满足标准[3]规定的要求;将其与德国r-biopharm己烯雌酚ELISA试剂盒相比,操作过程简单,检测成本低,检测时间短,因而该方法非常适于大批量检测水产品中己烯雌酚残留含量。同时,在试验中发现中华绒螯蟹样品的回收率比南美白对虾低,而在相同浓度下的相对平均偏差却较高。这可能与中华绒螯蟹样品脂肪含量相对较高,提取物经过2次净化有关。

4参考文献

[1] 中华人民共和国农业部.NY5070-2002 无公害食品、水产品中鱼药残留限量[S].北京:中国标准出版社,2002.

[2] 中华人民共和国卫生部.GB/T 5009.108-2003 畜禽肉中己烯雌酚的测定[S].北京:中国标准出版社,2002.

[3] 中华人民共和国农业部.SC/T 3020-2004 水产品中己烯雌酚残留量的测定 酶联免疫法[S].北京:中国农业出版社,2004.