南春辉

摘要:自从1889年Tanret从燕麦麦角菌中分离到麦角甾醇以来,人们开始对麦角甾醇进行了大量的研究。麦角甾醇(ergostero1) 又称麦角固醇,大量存在于酵母中,是一种重要的医药化工原料,可用于"可的松"、"黄体酮"等药物的生产。麦角甾醇受9到紫外线照射时可转化为维生素D2,是维生素D2的前身,也是生产甾体激素药物的重要原料。本文对近十年来麦角甾醇的研究予以综述,旨在为麦角甾醇的进一步应用奠定基础。

关键词:麦角甾醇;生物合成

1 生物合成途径

1.1麦角甾醇生物合成途径

麦角甾醇的生物合成是一个多酶参与的复杂的代谢过程。近年来,人们对真核细胞内麦角甾醇的生物合成做了大量的研究,对其生物合成途径有了比较详细的了解,其合成途径如下:

ERG9→鲨烯ERG1→ 环氧鲨烯ERG7→羊毛甾醇ERG11→4,4-二甲基-胆甾-8,14, 24 三烯醇ERG24 →4,4-二甲基酵母甾醇ERG25→酵母甾醇ERG6→粪甾醇ERG2→ 上位甾醇ERG3→ 麦角-5,7,24 (28) 三烯醇ERG5→麦角-5,7,22,24 (28) 四烯醇ERG4→ 麦角甾醇 [1]

1.2麦角甾醇生物合成途径有关基因的研究

ERG9 :ERG9 编码的蛋白为鲨烯合成酶,催化2分子焦磷酸法呢酯形成麦角甾醇生物合成途径中第一个固醇分子,是麦角甾醇合成的直接前提。有两家实验室克隆到了ERG9[2] ,在两家的研究当中ERG9 的营养缺陷型需补充麦角甾醇和有氧生长条件,用含ERG9 的质粒转化大肠杆菌,导致大肠杆菌内麦角甾醇的合成, ERG9 包含1个开阅框,编码444个氨基酸的蛋白质,蛋白分子量为51700,该基因在人与酵母之间高度保守,位于第Ⅷ染色体上。

ERG1:ERG1 编码产物为鲨烯环氧酶,该酶为需氧酶,催化鲨烯转化为2. 3 环氧鲨烯,利用该酶对丙烯胺敏感的特性克隆到了ERG1 基因[3] ,经分析发现,ERG1 基因包含1个开阅框,编码1个496氨基酸的蛋白质,位于第ⅩⅤ染色体上。

ERG7 :ERG7 编码的蛋白产物为羊毛甾醇合成酶,先后在热带假丝酵母( C. albicans) 和啤酒酵母(S. cerevisiae) 中克隆到该基因[4], ERG7 包含1个2 196bp 的开阅框,编码732 氨基酸的蛋白质。ERG7 位于达到第Ⅷ染色体上。

ERG11 :ERG11 编码产物为羊毛甾醇14α去甲基化酶-细胞色素P450 ,催化羊毛甾醇14α氧化脱甲基作用。Kalb 等从酵母中克隆到该基因[5],它含有单一的开阅框, 编码530 氨基酸的蛋白质,ERG11 被破坏的菌株需补充麦角甾醇及有氧生长条件。目前已经分别从高等植物、真菌、哺乳动物体内克隆出P450 基因并测序分析, 所有的P450 都含有500～600 个氨基酸残基,多序列联配结果表明高等植物、真菌、哺乳动物之间有35 %～42 %的序列同源性,说明P450 是非常保守的,P450还是许多抗真菌剂的作用靶位,对P450 基因及其产物的研究将为抗真菌新药的研发提供理论依据。ERG8 位于达到第Ⅷ染色体上。

ERG24 :ERG24 编码的蛋白产物是C-14 还原酶,催化4. 4-二甲基-胆甾-8. 14. 24 三烯醇还原为4. 4-二甲基酵母甾醇。ERG24 包含1个1314bp 的开阅框,编码438 氨基酸的蛋白质,蛋白质分子量为50612[6] 。该基因在染色体上的位置尚未确定。

ERG25 :ERG25 编码的蛋白产物为C24 固醇甲基氧化酶,M. Bard 等人首先在啤酒酵母中克隆到了该基因[7] , ERG25 突变体在菌体内积累4. 4-二甲基酵母甾醇, ERG25 对于啤酒酵母生长是必需的。ERG25 包含单一开阅框,编码309 氨基酸的蛋白质,存在于第Ⅶ染色体上。

ERG6 :ERG6 编码的产物为C-24 甲基化酶,存在于植物和真菌中,催化酵母甾醇C-24 位甲基化形成28 碳的甾醇结构,C-24 位甲基化对形成正常细胞膜是必需的 , ERG6 突变体对放线菌酮敏感,对制霉菌素具抗性,对ERG6 突变体必需补充色氨酸。ERG6 具单一开阅框,编码383 氨基酸的蛋白质,ERG6 定位在第ⅩⅢ染色体上。

ERG2 :ERG2 编码的蛋白为C-8 固醇异构酶,催化粪甾醇转化为上位甾醇,该酶是抗真菌药物吗琳的作用靶位。基因包含单一开阅框,编码222氨基酸的蛋白质。ERG2 定位于第ⅩⅢ染色体上。

ERG3 :ERG3 编码的蛋白产物为C-5 脱氢酶,催化上位甾醇还原为麦角-5. 7. 24 ( 28) 三烯醇。ERG3 存在于动物、植物、真菌中,包含单一开阅框,编码365 个氨基酸的蛋白质。ERG3 对S . cerevisiae 的生长是非必需的。ERG3 定位在第ⅩⅡ染色体上。

ERG5 :ERG5 编码的蛋白产物为C-22 固醇脱氢酶,催化麦角-5. 7. 24 (28) 三烯醇还原为麦角-5.7. 22. 24 (28) 四烯醇。该酶是麦角甾醇生物合成过程中第二个细胞色素P450 超家族蛋白质成员,与哺乳动物细胞色素P450 相似。ERG5 包含单一开阅框,编码538 氨基酸的蛋白质,定位在第ⅩⅢ染色体上。

ERG4 :ERG4 编码的蛋白产物为C-24 固醇还原酶,是麦角甾醇生物合成过程中最后一个酶,催化最终合成麦角甾醇,序列分析表明ERG4 与ERG24十分相似,有很高同源性 , ERG4 包含单一开阅框,编码473 氨基酸的蛋白质,位于第Ⅶ染色体上。

2生产工艺

2.1酵母发酵玉米秸秆产麦角甾醇工艺流程:

玉米秸秆→粉碎→蒸汽爆破→纤维素(半纤维素)→稀酸水解→六碳糖(五碳糖) →发酵→离心→皂化→提取→浓缩→麦角甾醇结晶。

2.2葡萄糖母液生产高麦角甾醇工艺流程

试管斜面→摇瓶种子→小小种子罐→小种子罐→中种子罐→大种子罐→处理好的原料+种子→发酵→分离→洗涤→分离→洗涤→分离→压棒→自溶→喷雾干燥→高麦角甾醇酵母粉→包装 取样化验一成品

2.3 红曲菌中提取麦角甾醇方法

筛选一株产麦角甾醇较高的红曲菌,在28摄氏度时,以小米作为基质,加水量为60%,在搅拌水中加入酵母膏和钙离子,发酵3天,可最大量产生麦角甾醇。

3分析方法

3.1通过单因素试验和正交优化试验筛选由红曲提取麦角甾醇的最佳条件。

利用HPLC检测麦角甾醇的含量,确定利用三氯甲烷为溶剂,在浸提比为1:250(g/m1),反应温度为50℃ 时,超声波下抽提20min为最佳反应条件,每g干由可获得9mg左右的麦角甾醇。

3.2建立高效液相色谱法测定冬虫夏草中麦角甾醇的含量测定方法。

采用ODS-C18色谱柱,甲醇为流动相,检测波长为282 nlTt,流速为1.3 ml/min。本法结果准确、简便可行、分析速度快、分离效果好。适用于冬虫夏草中麦角甾醇的含量测定。

3.3一种可准确、快速测定粮食中麦角甾醇含量的液相色谱方法。

样品皂化后,用正己烷萃取麦角甾醇,不需要进一步纯化,直接上液相色谱分析。分析柱为Spherisorb硅胶柱,检测波长282 nm。方法的检出限为0.1 mg/kg,方法的回收率在95.1% ～100.0% 。分析的准确度评价采用微量制备技术和反相液相色谱分离技术,证明了该方法分析的结果准确可靠。

4应用

4.1通过对麦角甾醇生物合成途径的研究,可以加入抗真菌药作用靶酶,来抑制麦角甾醇的合成,以至于减少禾谷丝核菌的生成,增加小麦的产量。

4.2以麦角甾醇为原料, KMnO4 为氧化剂, 一步法氧化反应得到活性四羟基麦角甾醇ergosta-8 (9) ,22- diene-3 ,5 ,6 ,7-tetrol (3β,5α,6α,7α,22 E) 和ergosta-8(14) ,22- diene-3 ,5 ,6 ,7-tetrol (3β,5α,6α,7α,22 E) ,该反应操作和分离纯化工艺简单, 产率高。

4.3麦角甾醇是真菌类的特征甾醇,是一种重要的维生素D源。其含量测定曾采用薄层扫描法,步骤繁杂,耗时过多。国外有人测定麦角甾醇的含量作为粮食发霉的定量指标,操作复杂繁琐。类似产品中麦角甾醇的含量测定多采用高效液相色谱法。本文将样品直接皂化,用环己烷提取,用分配柱和吸附柱净化和浓缩,用HPLC法测定其中麦角甾醇的含量,为控制其质量提供了可靠而简便的方法。

5展望

综上所述, 麦角甾醇具有重要的生理作用, 是食品、饲料及医药工业原料。麦角甾醇工业化生产,有两个途径微生物生物合成与化学合成。因甾体化合物分子含有不对称中心, 合成步骤多, 难度大,国内外广泛开展微生物发酵合成麦角甾醇的研究。目前麦角甾醇生物合成途径的研究取得了很大的进展,这将为通过基因工程手段获得高产麦角甾醇菌株和抗真菌药物设计提供理论指导,随着基因表达调控研究的推进,将为合理设计培养基和优化培养条件提供理论指导,从而构建高产菌株,优化培养条件,将会进一步提高麦角甾醇的产量。

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