王建佳　王永江　胡广利

摘要:目的:改进丹酚酸B的提取工艺,促进丹参制剂的发展。方法:采用SIPI905型大孔树脂用于丹酚酸B的提取分离,用HPLC法测定含量,考察大孔树脂的最佳工艺条件。结果:采用SIPI905型大孔树脂在4倍量的15%的乙醇洗脱条件下进行洗脱,得到的丹酚酸B的纯度为86.20%,精制度为252.62%。结论:SIPI905型大孔树脂能明显提高丹酚酸的收率和纯度。可适用于工业生产。

关键词 丹酚酸B;大孔树脂;提取;丹参

丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)的干燥根及根茎。始载于《神农本草经》,被列为上品,历代本草均有收载。丹参归心、肝经,药性微寒,味苦、无毒,具有祛瘀止痛、活血调经、养心除烦的功效[1]。其主要的药理作用部位分为水溶性和脂溶性两部分。总丹酚酸是丹参的水溶性有效成分之一, 在抗肝纤维化、抗动脉粥样硬化及细胞凋亡方面具有显著的活性[2],是目前临床上治疗冠心病、慢性肝炎等疾病的常用药物之一,其中丹酚酸B的含量最高,且活性最强,实验表明丹酚酸对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用[3],对心脏微血管内皮细胞也有延迟保护作用[4],同时能抗血栓[5]、改善β-淀粉样蛋白对神经元的毒性作用[6],增强老化红细胞提高T淋巴细胞分泌[7],具有抗衰老,抗肿瘤作用。

目前醇沉是被广泛应用的提取纯化工艺,70%醇沉法在沉去大量杂质同时,水溶性酚酸损失50%以上,丹参酮ⅡA则损失2/3以上,原儿茶醛亦有损失;60%醇沉法丹参酮ⅡA稍有损失[8]。由于丹酚酸在水溶液中不稳定,提取时受热易破坏,损失可达30%,如何寻找一种高效、实用的提取纯化工艺是丹酚酸B进一步开发研究的重要环节。本实验通过考察SIPI905型大孔吸附树脂对丹酚酸B的吸附能力,证明在丹酚酸的提取分离过程中,大孔树脂能明显提高丹酚酸B的纯度和收率。

1 药材与对照品

丹参药材由哈药集团世一堂制药厂提供, 经黑龙江中医药大学都晓伟教授鉴定为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根。

丹酚酸B(中国药品生物制品检定所)批号为111562-200706。

2 仪器与试剂

Waters515高效液相色谱仪;ORION MODEL 828型pH计;BP210S电子天平(德国Sartorius);KDM 型控温电热套(山东鄄城华鲁仪器公司);旋转蒸发仪RE52 (上海亚荣生化仪器厂) ;BRANSON SB3200-T型超声仪。SIPI905型大孔吸附树脂(上海医药工业研究院)。

甲醇为色谱纯。

乙醇、冰醋酸均为分析纯;水为超纯水(过0.145μm 滤膜)。

3 方法与结果

3.1 丹酚酸B的含量测定

3.1.1 对照品溶液的制备 精密称取丹酚酸B对照品12.01mg,用H2O溶解并定容于10ml容量瓶中作为对照品溶液,于4℃保存备用。

3.1.2 样品溶液的制备 药材粉碎过20目筛,混匀后用8倍量水浸泡1.5h,煎煮1.5h,第2次加6倍量水,煎煮1.0h,采用50%乙醇醇沉。制成比重为1.08的浸膏[9]。

取上述浸膏0.5g,置100mL量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液,于4℃保存备用(临用前,以0.45μm微孔滤膜过滤)。

3.1.3 色谱条件色谱柱Diamonsil ODS Cl8(200mm×4.6mm,5μm);流动相:甲醇:0.5%冰醋酸(1:7);流速:1.0ml/min;柱温:35℃;检测波长:281nm;进样量:20μl。

3.1.4 线性关系考察 分别取“3.1.1项” 对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6ml,加水定容至10ml, 得浓度为12.01、24.02、48.04、96.08、144.12、192.16μg/ml的对照品溶液,摇匀。按“3.1.5项”色谱条件分别进样,以对照品峰面积为纵坐标(Y),以丹酚酸B溶液的浓度为横坐标(X),得回归方程:Y=0.0233X+0.0481,r=0.9999,在12.01～192.16mg/ml范围内呈良好线性关系。

3.1.5 精密度考察 分别取对照品溶液低、中、高种浓度按“3.1.5项”色谱条件做精密度实验,结果表明日内精密度为1.08%,日间精密度RSD为1.84%。

3.1.6 稳定性考察 供试品溶液配制好后,每隔1h测定一次,结果显示5h内丹酚酸B的峰面积稳定,RSD为1.02%(n=5)。

3.1.7 回收率试验 取5份已知浓度为30.42mg/ml的样品5ml,分别加入对照品7.34、7.53、7.28、7.45、7.50mg适量,按“3.1.5项”色谱条件分别进样测定,结果显示平均加样回收率为99.78%,RSD为1.05%(n=5)。

3.2 SIPI905型大孔树脂提取丹酚酸B的工艺考察

3.2.1 大孔树脂的预处理及装柱 取SIPI905型大孔树脂用10倍量95%乙醇浸泡24h,湿法装柱,用95%乙醇冲洗,至洗出液加适量水混合无白色浑浊现象,最后用蒸馏水洗至无醇味,备用。

3.2.2 吸附容量的测定 精密量取样品溶液10ml上SIPI905型大孔树脂柱(1.5cm×25cm,湿树脂25g),控制流速1ml/min,过柱液流出后重吸附1次,静置30min,以蒸馏水冲洗,收集过柱液至10ml,平行操作3次,按“3.1.5项”色谱条件测定丹酚酸B含量,计算吸附容量(吸附容量为单位质量湿树脂吸附丹酚酸B的质量),结果表明其吸附容量为8.85mg/g(n=3)。

3.2.3 洗脱液的选择 精密量取样品溶液10ml,上SIPI905型大孔树脂柱(湿树脂100g),控制流速1ml/min,过柱液流出后重吸附1次,静置30min,依次用蒸馏水、10%乙醇、15%乙醇、20%乙醇、25%乙醇、30%乙醇各100ml洗脱,按“3.1.5项”色谱条件检测丹酚酸B。结果表明,丹酚酸B集中在15%乙醇洗脱液中,10%与20%乙醇虽能洗出丹酚酸B,但洗脱能力弱,其余洗脱液则均不含丹酚酸B,故确定15%乙醇为洗脱液。

3.2.4 精制程度考察 精密量取样品溶液10ml,上SIPI905型大孔树脂柱(湿树脂100g),控制流速1ml/min,过柱液流出后重吸附1次,静置30min,依次用蒸馏水、15%乙醇进行洗脱。洗脱体积分别为2、3、4、5倍量。另精密量取样品溶液10ml和醇洗脱液分别浓缩,干燥,称重,按“3.1.5项”色谱条件测定丹酚酸B含量。结果显示,在4倍量洗脱液体积的洗脱下,结果最理想,样品溶液固形物为1.47g,丹酚酸B含量为35.43%,醇洗脱液固形物为0.65g,丹酚酸B含量为86.20%, 丹酚酸B洗脱率为96.98%,精制程度为252.62%。

4 讨论

丹参的药用价值已经开始被临床广泛关注。丹参中水溶性成分以丹酚酸B的含量最高,有很好的开发前景。本文采用SIPI905型大孔树脂改进了丹酚酸B的提取工艺,具有吸附快,吸附容量大,洗脱率高等优点,比传统工艺[10]具有非常明显的优势,可以显著的提高丹酚酸的收率和纯度,而且方法操作简单,树脂再生简便,适合工业化生产,可有利促进丹参制剂的发展,具有较高的实用价值。

参考文献

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