陈国庆， 董倩男， 杨 锐， 高 瑛， 刘人嘉， 袁 林， 向 阳，2，， 吴 昊，△

（1湖北恩施学院医学部，湖北 恩施 445000；2湖北恩施学院附属恩施慧宜中西医结合风湿医院，湖北 恩施 445000；3湖北民族大学风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000）

肺癌是目前全球发生率和致死率较高的肿瘤之一。据统计，2021年约有235万新发肺癌病例和131万肺癌死亡病例［1］。肺癌中占比80%～85%的是非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer， NSCLC），其中中晚期确诊的人数比例较大，临床上NSCLC治疗方式主要包括传统药物治疗、抗血管生成治疗、免疫治疗以及靶向治疗等，但临床效果仍不理想，且在治疗过程中常发生不良反应［2-4］。因此，探索更多药物及方法治疗NSCLC具有重要意义。

研究发现，已有多种中药的总黄酮成分可调控多靶点、多通路并有效抑制肿瘤细胞增殖，发挥抗肿瘤效应［5］。湖北枫杨作为恩施民间常用的抗风湿药物，其中含有丰富的黄酮成分，湖北枫杨总黄酮（total flavonoids ofPterocarya hupehensisSkan， PHSTF）已被发现具有促进“类肿瘤样”细胞MH7A凋亡以及能调控Fas介导的死亡受体以诱导A549细胞凋亡的作用［6］，提示PHSTF可能作为一种潜在的药物治疗NSCLC，但PHSTF是否能够通过其他途径干预NSCLC还需进一步研究。

铁死亡是一种以细胞内铁过载、脂质过氧化为特征的程序性细胞死亡方式［7］，研究发现诱导肿瘤细胞铁死亡能够有效抑制肿瘤增殖及肿瘤耐药的发展［8］。基于此，本研究以A549细胞为研究对象，探究湖北枫杨总黄酮对A549铁死亡的影响，以期为临床治疗NSCLC提供研究基础。

材料和方法

1 材料

1.1 细胞株 A549细胞由湖北民族大学风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室赠与，培养液配制：RPMI 1640培养液、10%胎牛血清、1%青、链霉素混合，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2 药物及制备 本研究纯化的湖北枫杨总黄酮由湖北风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室赠与，芦丁法测得总黄酮纯度为78%。提取后先用DMSO初步溶解，使用时以培养液稀释（最终DMSO终浓度不超过0.1%）。

1.3 主要试剂及仪器 RPMI 1640培养液（货号：SH30027.01）购自Cytiva；胎牛血清（货号：C2910-0500）购自上海逍鹏生物科技有限公司；青、链霉素（货号：15140122）购自Gibco；芦丁标准品（货号S13033）购自广州硕谱生物科技有限公司；DMSO（货号：D1435）购 自Sigma；CCK-8试 剂 盒（货 号：KR0009）购自武汉科瑞生物技术有限公司；Transwell小室（货号：22521040）和Matrigel（货号：356234）购自Corning；0.1%结晶紫溶液（货号：G1063）购自北京索莱宝科技有限公司；谷胱甘肽（glutathione，GSH）测定试剂盒（货号：A006-2-1）购自南京建成生物工程研究所；PMSF蛋白酶抑制剂（货号：P1046）购自碧云天生物技术有限公司；RIPA裂解液（货号：G2002）购自武汉塞维尔生物科技有限公司；预染蛋白Marker（货号：26616）购自Thermo；PVDF膜和ECL发光液（货号分别为ISEQ00010和WBKLS0500）购自Millipore；溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11， SLC7A11）、谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein-1， Keap-1）、核因子E2相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2， Nrf2）和血红素加氧酶1（heme oxygenase-1， HO-1）抗体（货号分别为26864-1-AP、67763-1-Ig、10503-2-AP、80593-1-RR和10701-1-AP）购自Proteintech；山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG和β-actin抗体（货号分别为B900610、SA00001-1和20536-1-AP）购自Proteintech；铁死亡特异性抑制剂liproxstatin-1（Lip-1；货号：HY-12726）购自上海陶素药业有限公司。Multiscan Go酶标仪（Thermo Fisher Scientific）；IX73型倒置荧光显微镜（Olympus）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；311型CO2细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific）；Light Cycler 480 II实时荧光定量PCR仪（Roche）；ImageQuant LAS 4000mini生物分子成像仪（GE）。

2 方法

2.1 CCK-8法检测细胞活力 取对数生长期的A549细胞，每孔取100 μL （细胞密度为5×103/mL）的细胞悬液接种于96孔板，细胞贴壁生长12 h后，加含0、25、50、100、150及200 μg/mL的湖北枫杨总黄酮的培养液培养，每组6个复孔，另设空白组，放入培养箱中分别培养24、48、72 h后，向每孔加入CCK-8工作液10 μL，再放入培养箱孵育1 h，酶标仪下测定波长450 nm处各孔吸光度（A）值，计算细胞活力，实验独立重复3次。

2.2 划痕实验检测细胞迁移 取对数生长期的A549细胞，每孔取2 mL（每孔2×105个）的细胞悬液接种于6孔板中，待A549 细胞生长融合到达 80%后，在孔底部划3条等间距的平行线，随后用PBS反复冲洗3次，清除划落细胞，加入无血清培养液以及含25、50、100 μg/mL湖北枫杨总黄酮无血清培养液培养，分别拍下三条划痕照片，并用ImageJ软件进行面积分析，划痕愈合率（%）=（s0h-s24h或s48h）/s0h×100%。

2.3 Transwell实验检测细胞迁移及侵袭 取对数生长期的A549细胞每孔取2 mL（每孔2×105个）的细胞悬液接种于6孔板中，培养4 h后，加入无血清培养液以及含25、50、100 μg/mL湖北枫杨总黄酮无血清培养液培养24 h，收集细胞，并调整细胞密度为5.0×105/mL。将Transwell小室上室铺Matrigel基质胶（迁移实验时无基质胶），自然晾干。下室加入650 μL无血清DMEM，上室取100 μL各组细胞悬液。培养箱静置培养24 h后，用4%多聚甲醛固定细胞，随后用0.1%的结晶紫溶液染色，显微镜观察并拍照，用ImageJ软件计数，计算迁移、侵袭率的变化。

2.4 Lip-1与湖北枫杨总黄酮联合处理对A549细胞活力的影响 取对数生长期的A549细胞，每孔取100 μL的细胞悬液（5×103/mL）接种于96孔板，设置对照（control）组、铁死亡抑制剂Lip-1组、高剂量（200 μg/mL）PHSTF组和Lip-1+PHSTF （200 μg/mL）组。细胞贴壁生长12 h后，各给药组分别加入含培养液稀释的相应药物，每组设置6个复孔，继续培养24 h，按“2.1”项下方法测定细胞存活率。

2.5 细胞内GSH水平测定 取对数生长期的A549细胞，每孔取2 mL（每孔含2×105个细胞）细胞悬液接种于6孔板中，待细胞密度达80%后，设置对照组和湖北枫杨总黄酮100、150、200 μg/mL组，加入含相应药物的培养液处理24 h，胰酶消化后离心收集细胞，对细胞进行超声处理，操作过程中采用GSH试剂盒说明书中的步骤测定GSH水平。

2.6 RT-qPCR检测 按“2.5”项处理，收集细胞，根据试剂盒说明书提取总RNA，使用Prime ScriptTMRT Master和TB Green®Premix Ex TaqTM说明书进行cDNA反转录和qPCR。以β-actin为内参照，采用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。序列如下：SLC7A11上游引物序列为5′-TCTCCAAAGGAGGTTACCTGC-3′，下游引物序列为5′-AGACTCCCCTCAGTAAAGTGAC-3′；GPX4上 游 引 物 序 列 为5′-GAGGCAAGACCGAAGTAAACTAC-3′，下游引物序列为5′-CCGAACTGGTTACACGGGAA-3′；β-actin上游引物序列为5′-TGGCACCAGCACAATGAA-3′，下游引物序列为5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′，由上海生工合成。

2.7 Western blot检测 按“2.5”项处理及收集细胞。加入含PMSF的RIPA裂解液在冰上裂解A549细胞，裂解完成后把样本放入沸水中，加热使其蛋白变性，完成后采用BCA法定量。随后进行SDSPAGE实验，电泳完成后转至PVDF膜，TBST洗膜，用5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h， TBST洗膜4次（每次8 min），分别加入SLC7A11、GPX4、Keap-1、Nrf2、HO-1及β-actin Ⅰ抗（均为1∶10 00）于4 ℃ 环境中孵育过夜，TBST洗膜，加入Ⅱ抗（1∶10 000），室温孵育1.5 h后采用多功能凝胶成像仪进行化学发光显影，采用ImageJ软件进行灰度分析，统计蛋白相对表达量。

2.8 Lip-1与湖北枫杨总黄酮联合处理对A549细胞铁死亡相关蛋白表达的影响 按“2.4”项中分组处理细胞，待细胞密度达80%后，分别加入含相应药物的培养液，于培养箱中培养24 h。收集细胞，Western blot检测铁死亡相关蛋白的表达。

3 统计学处理

采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析，计量数据以均数±标准差（mean±SD）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 湖北枫杨总黄酮对A549细胞活力的影响

为了观察湖北枫杨总黄酮在不同浓度以及不同处理时间下对A549细胞活力的影响，我们加入（25、50、100、150和200 μg/mL）的湖北枫杨总黄酮分别处理细胞24、48和72 h，并通过CCK-8法以及细胞结晶紫染色法检测细胞活力。如图1所示，与未经加药处理的对照组相比，100、150、200 μg/mL的湖北枫杨总黄酮处理下的A549细胞活力均明显降低（P＜0.01），且呈时间与剂量相关性。因此在后续的迁移及侵袭实验中选用0、25、50、100 μg/mL的湖北枫杨总黄酮处理A549细胞；而在探究湖北枫杨总黄酮对A549细胞铁死亡的影响时，选用100、150、200 μg/mL的湖北枫杨总黄酮处理A549细胞。

Figure 1.Effect of total flavonoids of Pterocarya hupehensis Skan （PHSTF） on the viability of A549 cells.A： the cells were treated with different concentrations （25， 50， 100， 150 and 200 μg/mL） of PHSTF for 24， 48 and 72 h， and the cell viability was detec-ted by CCK-8 assay；B： the morphological changes of A549 cells was observed by microscopy（×100）.Mean±SD.n=6.*P＜0.05， **P＜0.01 vs 0 μg/mL PHSTF group.图1 湖北枫杨总黄酮对A549细胞活力的影响

2 湖北枫杨总黄酮对A549细胞迁移及侵袭的影响

为了探究湖北枫杨总黄酮能否通过抑制A549的迁移及侵袭，我们通过划痕实验以及Transwell实验检测发现，如图2所示，与对照组相比，随着湖北枫杨总黄酮给药剂量的增大，A549细胞的伤口愈合面积明显增大（P＜0.01），并且A549迁移与侵袭至下室的数量显著减少（P＜0.01），A549细胞的迁移及侵袭能力显著被抑制。实验结果表明湖北枫杨总黄酮可抑制A549细胞的迁移及侵袭。

Figure 2.Effect of total flavonoids of Pterocarya hupehensis Skan （PHSTF） on the migration and invasion of A549 cells.A： the cells were treated with different concentrations （25， 50 and 100 μg/mL） of PHSTF for 24 and 48 h， and the cell migration ability was detected by scratch assay；B： the cells were treated with different concentrations （25， 50 and 100 μg/mL） of PHSTF for 24 h， and the cell migration and invasion abilities were detected by Transwell assay.Mean±SD.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs 0 μg/mL PHSTF group.图2 湖北枫杨总黄酮对A549细胞迁移及侵袭的影响

3 Lip-1与湖北枫杨总黄酮联合处理对A549细胞活力的影响

为了探索湖北枫杨总黄酮能否通过除诱导A549细胞凋亡以外的途径抑制细胞增殖，我们联合铁死亡抑制剂Lip-1与湖北枫杨总黄酮处理细胞，观察Lip-1对湖北枫杨总黄酮引起的细胞活力下降的恢复效果，以此进一步论证其对A549细胞铁死亡的影响。如图3所示，CCK-8结果显示Lip-1对湖北枫杨总黄酮所致的细胞活力下降有恢复作用（P＜0.01），提示湖北枫杨总黄酮可能通过诱导A549细胞铁死亡抑制其增殖。

Figure 3.Effect of total flavonoids of Pterocarya hupehensis Skan （PHSTF） combined with ferroptosis inhibitor liproxstatin-1 （Lip-1） on the viability of A549 cells.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs PHSTF group.图3 湖北枫杨总黄酮与铁死亡抑制剂Lip-1联合处理对A549细胞活力的影响

4 湖北枫杨总黄酮对A549细胞GSH水平的影响

铁死亡的发生常伴随着GSH水平下降，为了进一步探讨湖北枫杨总黄酮对A549细胞铁死亡的诱导作用，我们通过GSH试剂盒检测发现，如图4所示，与未经过湖北枫杨总黄酮处理组比较，湖北枫杨总黄酮组随着给药量的增大，A549细胞GSH的含量逐渐降低（P＜0.01），提示在湖北枫杨总黄酮干预A549细胞后，A549细胞内脂质过氧化水平升高。

Figure 4.Effect of total flavonoids of Pterocarya hupehensis Skan （PHSTF） on GSH level in A549 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs 0 μg/mL PHSTF group.图4 湖北枫杨总黄酮对A549细胞内GSH水平的影响

5 湖北枫杨总黄酮对A549细胞铁死亡相关标志物mRNA表达的影响

通过RT-qPCR检测铁死亡相关标志物SLC7A11以及GPX4的mRNA表达水平，与未经过加药处理组比较，各剂量湖北枫杨总黄酮组A549细胞铁死亡标志物SLC7A11和GPX4 mRNA表达量随着药物剂量的升高显著降低（P＜0.01），见图5。实验结果表明湖北枫杨总黄酮能通过调控A549铁死亡抑制其增殖。

Figure 5.Effect of total flavonoids of Pterocarya hupehensis Skan （PHSTF） on the mRNA expression of ferroptosis markers in A549 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs 0 μg/mL PHSTF group.图5 湖北枫杨总黄酮对A549细胞铁死亡标志物mRNA表达的影响

6 湖北枫杨总黄酮对A549细胞铁死亡相关蛋白表达的影响

为了继续探索湖北枫杨总黄酮诱导A549细胞铁死亡的关键通路，我们通过Western blot实验发现，如图6所示，与未加药处理组比较，经湖北枫杨总黄酮干预后A549细胞内Keap-1蛋白表达水平随着湖北枫杨总黄酮剂量的增大显著升高（P＜0.01），SLC7A11、GPX4、Nrf2、HO-1蛋白表达水平随着湖北枫杨总黄酮剂量的增大明显下降（P＜0.01），表明Keap-1/Nrf2/HO-1通路可能是湖北枫杨总黄酮激活铁死亡的途径。

Figure 6.Effect of total flavonoids of Pterocarya hupehensis Skan （PHSTF） on ferroptosis-related protein expression in A549 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs 0 μg/mL PHSTF group.图6 湖北枫杨总黄酮对A549细胞铁死亡相关蛋白表达的影响

7 Lip-1与湖北枫杨总黄酮联合处理对 A549 细胞铁死亡相关蛋白表达

如图7所示，与湖北枫杨总黄酮组比较，Lip-1显著升高湖北枫杨总黄酮诱导的SLC7A11，GPX4，Nrf2、HO-1蛋白的表达水平（P＜0.01），显著下调湖北枫杨总黄酮诱导的Keap-1蛋白的表达水平（P＜0.01），进一步说明湖北枫杨总黄酮可通过调控Keap-1/Nrf2/HO-1通路诱导A549细胞铁死亡。

Figure 7.Effect of total flavonoids of Pterocarya hupehensis Skan （PHSTF） combined with ferroptosis inhibitors liproxstatin-1（Lip-1） on the expression levels of ferroptosis-related proteins in A549 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs PHSTF group.图7 湖北枫杨总黄酮与铁死亡抑制剂Lip-1联合处理A549细胞对铁死亡相关蛋白表达水平的影响

讨 论

在预防及治疗癌症过程中，通过诱导肿瘤细胞程序性死亡以及抑制肿瘤细胞的迁移与侵袭是癌症治疗的常见策略［9-10］。本研究中我们通过划痕以及Transwell实验发现湖北枫杨总黄酮可抑制A549细胞的迁移及侵袭且具有药物剂量依赖性，提示湖北枫杨总黄酮具有干预NSCLC的潜在特性。此外，有研究发现湖北枫杨总黄酮可通过诱导A549细胞凋亡从而抑制细胞增殖。为了探索湖北枫杨总黄酮能否通过其他途径抑制A549细胞增殖，在本研究中我们使用铁死亡抑制剂Lip-1联合湖北枫杨总黄酮处理A549细胞，观察到Lip-1可恢复湖北枫杨总黄酮对A549细胞活力的抑制。已有研究证明Lip-1能通过逆转tiliroside诱导的肝癌细胞铁死亡进而保护肝癌细胞存活［11］，表明湖北枫杨总黄酮具有潜在诱导A549细胞铁死亡从而抑制其增殖的特性。铁死亡作为一种独特的非凋亡型细胞程序性死亡方式，其发生的主要标志为脂质过氧化物升高，包括抗氧化的SLC7A11、GPX4蛋白活性降低以及GSH消耗等［12-13］。在本研究中我们发现随着湖北枫杨总黄酮剂量的增大，A549细胞中GSH含量以及SLC7A11、GPX4 mRNA及蛋白表达量显著减少，A549细胞脂质过氧化水平明显增高，表明湖北枫杨总黄酮可能诱导A549细胞铁死亡。为了进一步验证湖北枫杨总黄酮可通过诱导A549细胞铁死亡从而抑制细胞增殖，在本研究中我们发现Lip-1可升高湖北枫杨总黄酮所抑制的SLC7A11、GPX4蛋白表达量，提示湖北枫杨总黄酮能通过影响A549铁死亡从而抑制细胞增殖。

Keap-1/Nrf2/HO-1通路作为调控细胞铁死亡的关键通路之一，其中Nrf2是一种能通过抑制细胞内应激反应从而提高肿瘤细胞抗氧化能力的转录因子［14］。正常生理状态下，Nrf2在受Keap-1刺激后发生泛素化及蛋白酶降解，Nrf2表达水平降低，从而使若干下游抗氧化酶（如HO-1）的表达降低；然而在肿瘤细胞发生发展过程中Nrf2降解状态解除，随之Nrf2的激活促进下游HO-1等一系列抗氧化蛋白表达的升高，抑制肿瘤细胞内脂质过氧化水平，肿瘤细胞产生铁死亡抵抗，抑制Nrf2可以增强肺癌细胞对化疗药物的敏感性［15-17］。有研究发现麦冬皂苷B通过抑制Nrf2/HO-1通路诱导A549细胞铁死亡从而干预非小细胞肺癌的进展，柴胡皂苷A可通过抑制Nrf2/HO-1通路诱导A549铁死亡并增强顺铂对A549细胞的敏感性［18-19］。本研究发现湖北枫杨总黄酮可升高Keap-1的表达，降低A549细胞Nrf2、HO-1的表达，提示湖北枫杨总黄酮可能通过Keap-1/Nrf2/HO-1通路诱导A549细胞铁死亡。本研究使用湖北枫杨总黄酮联合铁死亡特异性抑制剂Lip-1处理A549细胞，我们发现Lip-1可升高湖北枫杨总黄酮抑制的Nrf2、HO-1蛋白表达，并降低湖北枫杨总黄酮诱导的Keap-1蛋白表达。

综上所述，本实验表明湖北枫杨总黄酮也可通过非凋亡的铁死亡途径抑制A549细胞增殖，其作用机制与降低SLC7A11以及GPX4的表达并升高A549细胞脂质过氧化水平有关，Keap-1/Nrf2/HO-1通路在该过程中发挥关键作用。后续对于湖北枫杨总黄酮诱导A549铁死亡的其他途径以及联合现有化疗药物能否达到更好的结果有待进一步研究。