高 敏， 丁欢欢， 郑丽华， 王 娟

（新疆医科大学第五附属医院心内科，新疆 乌鲁木齐 830001）

心血管疾病是我国主要的死亡因素，其致死人数从2005年309万增加到2020年458万［1］，严重困扰着我国居民身心健康，加重了国家经济财政压力。常见的心血管疾病主要包括冠心病、心肌梗死、主动脉狭窄和心力衰竭等。心肌纤维化（myocardial fibrosis， MF）几乎见于所有类型的心脏病［2］。因此，抑制心肌纤维化的发生发展极为关键。

穿心莲内酯（andrographolide， Andr）为穿心莲的主要活性成分，具有抗炎、免疫调节等多种生物学活性，对急性肾衰竭、糖尿病肾病和原发性肾病综合征等多种肾脏疾病具有治疗作用［3-4］，对四氯化碳所致肝纤维化和博来霉素所致肺纤维化具有明显抑制作用［5-6］，在减少心脏纤维化和改善心脏功能方面有着显著疗效［7］，但其功效行使的生物学功能仍不明晰。

转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是一种多效细胞因子，参与调节多种生物学过程，是心血管疾病的潜在治疗靶点［8］。c-SKI （cellular Sloan-Kettering Institute）蛋白是TGF-β1信号传导的重要核心抑制剂，能够结合并抑制Smad蛋白活性［9-10］。本课题组前期工作已证实c-SKI和TGF-β1的关系，c-SKI能抑制TGF-β1诱导的人心肌成纤维细胞增殖和细胞外基质（extracellular matrix， ECM）沉 积［11］，过 表 达c-SKI介 导TGF-β1/Smad和p38 MAPK信号通路能够缓解心房颤动［12］，抑制异丙肾上腺素（isoprenaline， ISO）诱导的小鼠心肌纤维化［13］，抑制人冠状动脉内皮细胞的内皮-间充质转化过程［14］。过表达c-SKI可以减轻血管紧张素II诱导的心肌纤维化［15］。因此，本研究拟通过构建心肌纤维化小鼠模型，探究Andr通过c-SKI影响TGF-β1抑制心肌细胞转分化和心肌纤维化的作用机制，以期为心肌纤维化的治疗提供参考。

材料和方法

1 动物

C57雄性小鼠18只，8周龄，（20.0±2.0） g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SCXK（湘）2019-0004。人心脏成纤维细胞（human cardiac fibroblasts， HCFBs）购自中国科学院细胞库（上海）。

2 主要试剂

CCK-8试剂盒购于碧云天生物技术有限公司；mRNA提取试剂盒和定量PCR试剂盒购于Thermo Fisher；c-SKI、纤连蛋白1（fibronectin 1， FN1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin， α-SMA）、波形蛋白（vimentin）、I型胶原（collagen type I， Col I）和GAPDH抗体，以及兔抗鼠和鼠抗兔Ⅱ抗购于Abcam。

3 主要方法

3.1 小鼠心肌纤维化模型构建 将18只雄性C57小鼠随机分成3组：control组、模型组（ISO组）和ISO+Andr组，每组6只。ISO组和ISO+Andr组小鼠给予皮下注射5 mg/kg的ISO 1 d后，每天同一时点皮下注射2.5 mg/kg的ISO，持续注射30 d；control组注射生理盐水［16］。ISO+Andr组Andr灌胃，control组和ISO组均给予等体积生理盐水灌胃。给药8周，处死小鼠，取心脏组织进行病理检测。

3.2 HE染色 将小鼠心脏组织在4%多聚甲醛中固定，经梯度酒精脱水、石蜡包埋、切片、苏木素染色、1%盐酸酒精分化、1%氨水返蓝、伊红复染、脱水、透明、封片，镜检观察心肌组织病理学变化。

3.3 Masson染色 将小鼠心脏组织于4%多聚甲醛固定，经切片、脱蜡入水、透明、浸泡、苏木素染色、乙酸分化、Masson返蓝、丽春红复染、脱水、封片，镜检观察并拍照，用Image-Pro Plus 6.0软件分析并计算胶原容积分数。

3.4 免疫组化 取小鼠心脏组织石蜡切片，经脱蜡、水化、切片，Ⅰ抗4 ℃孵育过夜，相应Ⅱ抗处理15 min，苏木素复染、脱水、透明、封片，镜检观察并拍照。

3.5 细胞培养及分组 将HCFBs培养于含10%胎牛血清、1%青/链霉素双抗的DMEM-F12培养液中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养至对数生长期进行后续实验。以不同浓度（0、10、50和100 μmol/L）的Andr干预HCFBs。接着用50 μmol/L Andr处理10 μg/L TGF-β1诱导的转分化细胞模型，具体分组为：PBS组、模型组（TGF-β1组）和TGF-β1+Andr组。使用Lipofectamine 3000将sh-NC质粒和sh-c-SKI质粒转染至TGF-β1诱导的模型组细胞，并联合Andr处理细胞，具体分组为：PBS组、TGF-β1组、TGF-β1+Andr组、TGF-β1+Andr+sh-NC组和TGF-β1+Andr+sh-c-SKI组。收集细胞用于进一步分析。

3.6 倒置荧光显微镜观察 将HCFBs接种于6孔板中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜，药物干预后，置于倒置显微镜下以不同视野、不同倍数明场观察细胞形态和生长密度，并拍照。

3.7 CCK-8实验 将HCFBs按实验分组处理后，接种至96孔板中，培养48 h，弃上清，每孔加入10 μL CCK-8溶液继续孵育4 h，酶标仪测定波长450 nm处的吸光度。

3.8 实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR， qPCR） 提取组织和细胞总RNA，计算上样体积，以逆转录得到的cDNA为模板，通过高温变性、退火和延伸等步骤进行qPCR分析，观察熔解曲线并用2-ΔΔCt法分析c-SKI的mRNA相对表达水平。引物序列见表1。

表1 引物序列Figure 1.Sequences of the primers

3.9 Western blot 提取组织、细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，取适量蛋白样品进行电泳、转膜、5%脱脂奶粉室温封闭、4 ℃过夜孵育Ⅰ抗、室温孵育相应Ⅱ抗2 h、显影拍照，并使用ImageJ软件进行灰度分析并计算相对表达量。

4 统计学处理

使用GraphPad Prism 9.0进行统计并绘制图表。两组间比较采用t检验，多组间采用单因素方差（ANOVA）分析，数据以均数±标准差（mean±SD）表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Andr在小鼠心肌纤维化模型中的干预作用

HE和Masson染色显示，control组小鼠胞核均一，心肌细胞排列整齐，细胞间紧密连接；ISO组小鼠细胞核固缩变形，心肌组织破坏、有大量蓝色胶原纤维沉积，纤维化程度严重；与ISO组相比，ISO+Andr组小鼠心肌纤维排列整齐，心肌细胞形态基本正常，细胞膜完整，胶原容积分数显著减少（P＜0.01），见图1A、B。免疫组化和qPCR结果显示，与control组相比，ISO组c-SKI表达显著下调（P＜0.01）；与ISO组相比，ISO+Andr组c-SKI表达显著上调（P＜0.05），见图1C、D。Western blot结果显示，与control组相比，ISO组c-SKI表达显著下调（P＜0.01），FN1、α-SMA、vimentin和Col I表达显著上调（P＜0.01）；与ISO组相比，ISO+Andr组c-SKI表达显著上调（P＜0.01），FN1、α-SMA、vimentin和Col I表达显著下调（P＜0.01），见图1E、F。

Figure 1.Effects of andrgrapholide（Andr） on myocardial fibrosis model in mice.A： HE staining（scale bar=50 μm）；B： Masson staining（scale bar=50 μm）；C： the level of c-SKI was detect by immunohistochemical staining（scale bar=50 μm）；D：the level of c-SKI mRNA was detected by qPCR；E： the level of c-SKI was detect by Western blot；F： the levels of fibronectin 1 （FN1）， α-smooth muscle actin （α-SMA）， vimentin and collagen type I（Col I） were detected by Western blot.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05， ##P＜0.01 vs isoprenaline （ISO） group.图1 穿心莲内酯对小鼠心肌纤维化模型的干预作用

2 Andr对HCFBs增殖及ECM相关蛋白的影响

50 μmol/L和100 μmol/L Andr处理HCFBs 48 h后，c-SKI表达显著上调（P＜0.01），细胞活力显著下降（P＜0.01），见图2A、B。选用50 μmol/L Andr作为最低有效剂量进行后续实验。Western blot结果显示，与PBS组相比，Andr组FN1、α-SMA、vimentin和Col I表达显著下调（P＜0.01），见图2C。

Figure 2.Effect of andrgrapholide （Andr） on the viability and extracellular matrix-related protein expression in human cardiac fibroblasts （HCFBs）.A： the protein level of c-SKI was detected by Western blot；B： the cell viability was detected by CCK-8 assay；C： the protein levels of fibronectin 1 （FN1）， α-smooth muscle actin （α-SMA）， vimentin and collagen type I （Col I） were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs PBS group.图2 穿心莲内酯对人心脏成纤维细胞活力和细胞外基质相关蛋白表达的影响

3 Andr对TGF-β1诱导HCFBs的影响

与PBS组相比，TGF-β1组细胞数量增多，细胞形态改变；与TGF-β1组相比，TGF-β1+Andr组细胞形态基本恢复正常，见图3A。Western blot结果显示，与PBS组相比，TGF-β1组细胞中FN1、α-SMA、vimentin和Col I表达显著上调（P＜0.01）；与TGF-β1组相比，TGF-β1+Andr组FN1、α-SMA、vimentin和Col I表达显著下调（P＜0.01），见图3B。qPCR和Western blot结果显示，与PBS组相比，TGF-β1组c-SKI表达显著下调（P＜0.01）；与TGF-β1组相比，TGF-β1+Andr组c-SKI表达显著上调（P＜0.01），见图3C、D。

Figure 3.Effect of andrgrapholide （Andr） on transforming growth factor-β1 （TGF-β1）-induced human cardiac fibroblasts （HCFBs）.A： the cell morphology was observed by microscope （scale bar=100 μm）；B： the levels of fibronectin 1 （FN1）， α-smooth muscle actin （α-SMA）， vimentin and collagen type I （Col I） were detected by Western blot；C： the mRNA level of c-SKI was detected by qPCR；D： the protein level of c-SKI was detected by Western blot.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs PBS group；##P＜0.01 vs TGF-β1 group.图3 穿心莲内酯对转化生长因子β1诱导的人心脏成纤维细胞的影响

4 敲减c-SKI联合Andr对TGF-β1诱导HCFBs细胞增殖与ECM沉积的影响

Western blot结果显示，与PBS组相比，TGF-β1组c-SKI表达显著下调（P＜0.01），FN1、α-SMA、vimentin和Col I表达显著上调（P＜0.01）；与TGF-β1组相比，TGF-β1+Andr组c-SKI表达显著上调（P＜0.01），FN1、α-SMA、vimentin和Col I表达显著下调（P＜0.01）；与TGF-β1+Andr+sh-NC组相比，TGF-β1+Andr+sh-c-SKI组c-SKI表达显著下调（P＜0.01），FN1、α-SMA、vimentin和Col I表达显著上调（P＜0.05），见图4A。CCK-8实验结果显示，与PBS组相比，TGF-β1组细胞活力显著上升（P＜0.01）；与TGFβ1组相比，TGF-β1+Andr组细胞活力显著下降（P＜0.05）；与TGF-β1+Andr+sh-NC组相比，TGF-β1+Andr+sh-c-SKI组细胞活力显著上升（P＜0.05），见图4B。

Figure 4.Effects of c-SKI knockdown combined with andrgrapholide （Andr） on the viability and extracellular matrix deposition of human cardiac fibroblasts （HCFBs） induced by transforming growth factor-β1 （TGF-β1）.A： the levels of c-SKI， fibronectin 1 （FN1）， α-smooth muscle actin （α-SMA）， vimentin and collagen type I （Col I） were detected by Western blot；B： the cell viability was measured by CCK-8 assay.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs PBS group；#P＜0.05， ##P＜0.01 vs TGF-β1 group；△P＜0.05， △△P＜0.01 vs TGF-β1+Andr+sh-NC group.图4 敲减c-SKI联合穿心莲内酯对转化生长因子β1诱导的人心脏成纤维细胞活力和细胞外基质沉积的影响

讨 论

MF是对心肌损伤的反应性重塑过程，主要表现为心肌成纤维细胞增殖，分泌ECM蛋白替代受损组织。然而，ECM的过度产生和沉积，以及I型和III型胶原比例的上升，导致病理性纤维化重塑，从而促进心脏功能障碍的发展，最终导致心力衰竭，并增加死亡率。目前MF得不到很好的控制，是治疗中仍待解决的难题。

Andr是从亚洲广泛存在的草本穿心莲中提取的二萜类化合物，因其具有抗病毒、抗炎、抗肿瘤等多种生物活性而被广泛应用，在保护心血管系统和神经系统上具有独特优势［17］。Das等［18］的研究发现，Andr能够通过抑制NF-κB通路抑制肾炎小鼠肾组织纤维化，显著抑制心肌梗死小鼠的心脏肥大、心脏纤维化、炎症反应等，缓解不良心脏重塑，增强Nrf2表达，减轻心肌梗死后的氧化应激［19］。在本研究中，我们利用不同浓度的Andr干预HCFBs后发现，细胞数量明显减少，且药物浓度越高抑制作用越明显，c-SKI显著上调，FN1、α-SMA、vimentin和Col I显著下调，表明Andr能有效抑制心肌纤维化，降低ECM相关蛋白水平，其作用可能与c-SKI表达相关。

TGF-β1是TGF-β最常见的一种亚型，对免疫细胞发育和成熟、维持免疫耐受、体内平衡及调节免疫反应都极为关键［20］，在心脏和血管形态发生及心血管稳态空间和时间调节中也起重要作用［21］。众所周知，成纤维细胞的激活及其向肌成纤维细胞转化是由TGF-β1介导的［22］。Liu等［23］发现，C188-9通过抑制TGF-β1信号通路诱导的成纤维细胞活化，缓解ISO诱导的小鼠心脏纤维化。Jurcic等［24］发现，上调ECM蛋白水平能促进组织纤维化，而ECM的生成需要I型和III型胶原蛋白。本实验结果显示，TGF-β1组HCFBs数量明显增多，细胞形态改变，细胞中FN1、α-SMA、vimentin和Col I表达显著上调，即TGFβ1能够诱导心肌成纤维化；与TGF-β1组相比，加入Andr干预后，细胞形态恢复正常，细胞数量减少，FN1、α-SMA、vimentin和Col I表达显著下调，即Andr能够逆转TGF-β1诱导的心脏成纤维化，影响成纤维细胞活力，减少ECM沉积。

本课题组前期已证实过表达c-SKI可显著抑制成纤维细胞和冠状内皮细胞增殖，其作用机制可能与抑制TGF-β/Smad信号通路有关［25］，同时c-SKI在快速心房起搏犬模型的心房组织中显著下调，过表达c-SKI能抑制心房胶原沉积，且通过TGF-β1-Smad途径逆转心房颤动诱导的心房重塑［26］。在治疗肾纤维化的过程中，上调c-SKI表达可以抑制TGF-β1活性，阻止肾纤维化进程［27］。凌佳等［28］发现，c-SKI沉默不会影响大鼠心肌细胞H9C2的增殖能力，但其侵袭和迁移能力均增强。本实验先前已证实Andr促进c-SKI表达，TGF-β1的作用则相反。之后，与TGFβ1+Andr+sh-NC组相比，TGF-β1+Andr+sh-c-SKI组c-SKI表达显著下调，FN1、α-SMA、vimentin和Col I表达显著上调，提示敲减c-SKI逆转了Andr对HCFBs活力和ECM沉积的抑制作用。

综上所述，Andr能有效抑制心肌纤维化和心肌成纤维细胞增殖，减少ECM沉积，其作用机制可能与调控c-SKI表达、影响TGF-β1信号通路有关。下一步应探究Andr介导c-SKI抑制心肌成纤维细胞转分化和心肌纤维化与TGF-β1信号通路的具体分子作用机制，为心肌纤维化发生发展的分子机制提供参考，给心力衰竭患者带来新的治疗思路。