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单核细胞增生性李斯特氏菌tatD 基因缺失对小鼠毒力和肠道菌群的影响

2024-02-25牛俊辉毛福超贾艳艳张春杰程相朝廖成水

浙江农林大学学报 2024年1期
关键词:氏菌李斯特单核细胞

牛俊辉,李 琦,毛福超,钱 满,贾艳艳,丁 轲,张春杰,程相朝,廖成水

(1.河南科技大学 动物科技学院 功能微生物与畜禽健康实验室,河南 洛阳 471023;2.河南科技大学 洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室,河南 洛阳 471023;3.河南科技大学 动物疫病与公共卫生重点实验室,河南 洛阳 471023)

单核细胞增生性李斯特氏菌Listeriamonocytogenes是一种重要食源性人畜共患致病菌[1],侵入机体后可穿过肠道屏障,经淋巴和血液循环进入肝脏和脾脏,随后到达大脑和胎盘[2],引起败血症、脑膜炎以及早产或流产等症状[3]。单核细胞增生性李斯特氏菌广泛存在于牛奶、蔬菜和动物性食品等供应链中,由其引发的食物中毒病例逐年增多,虽然人类感染单核细胞增生李斯特氏菌发病率相对较低,但一旦感染死亡率可达30%~70%,占食源性病原菌感染死亡的半数以上[4]。单核细胞增生性李斯特氏菌分泌的胞外蛋白在细菌感染宿主中发挥着重要作用。细菌存在多种分泌系统将效应蛋白转运至胞外,其中双精氨酸转运系统(twinagininetranslocation,Tat)是运输完全折叠蛋白质的一种分泌系统[5]。

双精氨酸转运系统D (twinagininetranslocation D,TatD)是一种高度保守蛋白,广泛存在于微生物中,可作为一种重要的毒力因子参与修复DNA、降解胞外诱捕网和诱发细胞程序性凋亡[6]。伊氏锥虫Trypanosomaevansi和路氏锥虫Trypanosomalewisi可分泌TatD 蛋白,降解巨噬细胞胞外诱捕网以对抗宿主的固有免疫反应[7]。毛福超[8]研究发现:单核细胞增生性李斯特氏菌TatD 重组蛋白具有核酸酶活性,同时通过重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术获得了tatD基因缺失菌株(LM10403sΔtatD),但关于单核细胞增生性李斯特氏菌tatD基因对动物的毒力和肠道菌群影响仍不清楚。因此,本研究以小鼠Musmusculus为试验动物,将LM10403sΔtatD口服感染小鼠,观察tatD基因缺失后的单核细胞增生性李斯特氏菌对小鼠毒力和肠道菌群多样性的影响,为进一步探究tatD基因在单核细胞增生性李斯特氏菌与宿主互作中的具体作用以及减毒疫苗研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

单核细胞增生性李斯特氏菌亲本菌株(LM10403s)、缺失菌株(LM10403sΔtatD)和互补菌株(LM10403sCΔtatD)存于洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室,6 周龄雌鼠购自郑州中原动物实验中心。琼脂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。卡那霉素购自金克隆(北京)生物技术有限公司。脑心膜浸出液(BHI)肉汤购自青岛海博生物技术有限公司。粪便基因组DNA 提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;TksGflex DNA Polymerase 购自宝日医生物技术(北京)有限公司;DNA 凝胶快速纯化试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 菌株的复苏与培养

将单核细胞增生性李斯特氏菌LM10403s 和LM10403sΔtatD接种于BHI 固体培养基上复苏,将LM10403sCΔtatD接种于含卡那霉素的BHI 固体培养基上复苏,37 ℃恒温培养箱中培养12~16 h。挑取LM10403s 和LM10403sΔtatD单个菌落接种于BHI 肉汤中,挑取LM10403sCΔtatD单个菌落接种于含卡那霉素的BHI 肉汤中,37 ℃过夜振荡培养备用。

1.3 菌株对小鼠的毒力测定

用无菌生理盐水将新鲜培养的LM10403s、LM10403sΔtatD和LM10403sCΔtatD洗涤后进行连续10 倍稀释,选取5 个稀释度的细菌分别给予小鼠口服灌胃,每个稀释度10 只小鼠,每只100 μL,灌胃前12 h 禁食禁水,接种2 h 后正常饲喂。以给予生理盐水的小鼠作为对照,持续观察各处理组小鼠症状直至无小鼠死亡。将死亡小鼠的肝脏无菌接种到BHI 固体培养基上,用单核细胞增生性李斯特氏菌引物进行PCR 扩增鉴定。采用Bliss 法得到菌株对小鼠的半数致死量(LD50)。

1.4 缺失菌株的免疫保护率测定

用无菌生理盐水将新鲜培养的LM10403sΔtatD洗涤后调整细菌浓度,以1.00×105CFU 的剂量给予小鼠口服灌胃,灌胃前12 h 禁食禁水,接种2 h 后正常饲喂。于首次免疫7 d 后按相同剂量进行第2 次免疫,第2 次免疫7 d 后以给予1.00×1010CFU 的剂量对小鼠进行亲本菌株的攻毒。随后持续观察直至连续7 d 无小鼠死亡,记录各处理组小鼠症状及死亡情况。以未免疫强毒攻毒组和健康组为对照评价tatD基因缺失菌株的免疫保护效果。

1.5 菌株对小鼠肠道菌群的影响

1.5.1 动物分组与处理 将40 只6 周龄昆明雌鼠适应性饲养7 d,随机平分为磷酸缓冲盐溶液(PBS)、LM10403s、LM10403sΔtatD和LM10403sCΔtatD处理组。分别灌胃200 μL 含1.00×106CFU 的菌液,对照组小鼠灌胃200 μL 无菌PBS,灌胃前12 h 断食,并口服体积分数为10%的Na2HCO3中和胃酸。灌胃24 h 后采用颈椎脱臼剖杀小鼠,立即收集肠道内容物。

1.5.2 小鼠肠道微生物基因组DNA 提取与高通量测序 利用粪便基因组试剂盒提取基因组DNA,采用质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000 测定DNA 浓度。以基因组DNA 为模板,针对细菌V3~V4 作为目标区域进行扩增。引物:343F (5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′)和798R (5′-AGGGT ATCTAATCCT-3′)。琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物,磁珠法纯化PCR 产物。送往上海欧易生物医学科技有限公司利用Illumina Hiseq 2500 (PE250)系统进行高通量测序。

1.5.3 生物信息学分析 高通量测序得到的4 组小鼠原始图像数据文件经碱基识别,分析转化为原始双端序列。利用Trimmomatic (v 0.35)、FLASH (v 1.2.11)、split_libraries (v 1.8.0)和UCHIME (v 2.4.2)等软件对原始序列进行质控,得到优质序列。使用Vsearch (v 2.4.2)软件按照97%的相似度进行操作分类单元(OTU)分类[9],并进行Alpha 和Beta 多样性分析以及菌群构成分析。比较4 个处理组小鼠肠道菌群在门和属水平的分布差异。采用PICRUSt 软件结合京都基因及基因组百科全书(KEGG)分析各组小鼠肠道菌群信号通路富集情况。

1.6 统计分析

采用GraphPad Prism (v 8.0.1)软件对数据进行差异性检验,显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 缺失菌株对小鼠毒力的影响

从表1 可见:小鼠经口服接种不同稀释含量的LM10403s、LM10403sΔtatD和LM10403sCΔtatD后,各组均有小鼠死亡,而无菌生理盐水对照组的小鼠均未发生死亡。PCR 扩增鉴定死亡小鼠肝脏分离的细菌为单核细胞增生性李斯特氏菌。通过Bliss 法计算得到LM10403sΔtatD口服感染小鼠的LD50为8.11×107CFU,LM10403s 的LD50为1.23×107CFU,LM10403sCΔtatD的LD50为1.94×107CFU。表明单核细胞增生李斯特氏菌敲除tatD基因后毒力下降。

表1 不同菌株的毒力测定Table 1 Strain virulence determination of bacterial strain

2.2 LM10403sΔtatD 的免疫保护率

LM10403sΔtatD经灌胃第2 次免疫7 d 后,将LM10403s 调整为1.00×1010CFU 对小鼠进行攻毒。结果显示:未免疫的LM10403s 攻毒组小鼠于攻毒后全部死亡,无菌生理盐水对照组小鼠未发生死亡。而免疫LM10403sΔtatD的接种组共2 只小鼠死亡,死亡时间分别为攻毒感染后的第6 天和第9 天,其余存活小鼠的精神状态良好,免疫保护率为80%。表明单核细胞增生性李斯特氏菌tatD基因缺失菌株能够对亲本菌株感染小鼠产生较好的免疫效果。

2.3 tatD 基因缺失对单核细胞增生性李斯特氏菌感染小鼠肠道微生物OTU 分布的影响

对质控得到的优质序列,按照97%的相似度进行OTU 分类,采用维恩图对4 个处理组OTU 分布情况进行分析。PBS、LM10403s、LM10403sΔtatD和LM10403sCΔtatD4 个处理独有的OTU 分别为1 703、755、1 057 和597 个,4 组共有1 781 个OTU。肠道菌群多样性由高到低依次为PBS、LM10403-sΔtatD、LM10403s、LM10403sCΔtatD处理组(图1)。表明tatD基因缺失后使得单核细胞增生性李斯特氏菌感染小鼠后肠道菌群多样性增加。

图1 tatD 基因缺失对单核细胞增生性李斯特氏菌感染小鼠肠道微生物的OTUs 维恩图Figure 1 OTUs venn diagram of tatD gene deletion on intestinal microorganisms of L.monocytogenes infected mice

2.4 tatD 基因缺失对单核细胞增生李斯特氏菌感染小鼠肠道微生物Alpha 多样性的影响

从图2 可见:4 个处理样品的Shannon 指数和Simpson 指数差异不显著。Chao1 和Observed species指数显示:PBS 与LM10403sΔtatD处理组差异不显著,但LM10403s 和LM10403sCΔtatD处理组相比于PBS 处理组显著下降(P<0.05)。表明各处理小鼠肠道菌群物种均匀度相差不大,但亲本菌株感染小鼠时肠道菌群丰富度显著降低。

图2 tatD 基因缺失对单核细胞增生性李斯特氏菌感染小鼠的Alpha 多样性分析Figure 2 Alpha diversity index analysis of L.monocytogenes infected mice by deletion of the tatD gene

2.5 tatD 基因缺失对单核细胞增生性李斯特氏菌感染小鼠肠道微生物Beta 多样性的影响

Beta 多样性包括多种分析方法,其中非度量多维尺度分析(NMDS)能更好地反映生态学数据的非线性结构,相同颜色为相同分组,同一组的样本距离越近,并与其他组有明显距离,说明分组效果好。图3显示:PBS 与各处理组样本距离较远,LM10403sΔtatD与LM10403s、LM10403sCΔtatD处理组距离相对远,LM10403s 和LM10403sCΔtatD处理组样本的聚集相近。表明LM10403sΔtatD与LM10403s、LM-10403sCΔtatD处理组群落存在差异,但差异不大。

图3 tatD 基因缺失对单核细胞增生性李斯特氏菌感染小鼠的Beta 多样性分析Figure 3 Beta diversity index analysis of L.monocytogenes infected mice by deletion of the tatD gene

2.6 单核细胞增生性李斯特氏菌tatD 缺失对小鼠肠道门水平微生物种群分布的影响

在门水平上,使用平均丰度前50 位的门丰度数据绘制热图。结果显示:优势菌门为厚壁菌门Firmicutes、变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteria、梭杆菌门Fusobacteria 和拟杆菌门Bacteroidetes。LM10403sΔtatD处理组的厚壁菌门丰度明显高于LM10403s 和LM10403sCΔtatD处理组,拟杆菌门明显低于LM10403s 和LM10403-sCΔtatD处理组(图4)。表明单核细胞增生性李斯特氏菌tatD基因缺失后,厚壁菌门明显增加,且与PBS 处理组结果相似。

图4 单核细胞增生性李斯特氏菌tatD 缺失株感染小鼠肠道门水平微生物种群的热图分析Figure 4 Heatmap graph of gut microbiota in mice after tatD mutant of L.monocytogenes infection at the phylum level

2.7 单核细胞增生性李斯特氏菌tatD 缺失对小鼠肠道属水平微生物种群分布的影响

在属水平上,LM10403s、LM10403sΔtatD和LM10403sCΔtatD处理组要由乳杆菌属Lactobacillus、拟杆菌属Bacteroides和肠杆菌属Enterorhabdus组成。LM10403sΔtatD处理组的乳杆菌属相对丰度明显高于LM10403s 和LM10403sCΔtatD处理组(图5)。表明tatD基因缺失使单核细胞增生性李斯特氏菌感染的小鼠肠道菌群中乳杆菌属增加。

2.8 单核细胞增生性李斯特氏菌tatD 对小鼠肠道微生物KEGG 的功能预测

为进一步分析tatD基因缺失后小鼠肠道菌群改变引起的信号通路富集的差异,采用PICRUSt 软件结合KEGG,分析4 组小鼠在遗传信息处理、生物体系统、新陈代谢、疾病、细胞过程和环境信息处理信号通路富集的差异。结果显示:LM10403sΔtatD和PBS 处理组6 类生物代谢通路相关性较低,而LM10403s 处理组具有较高的相关性(图6)。表明tatD基因缺失可能在单核细胞增生性李斯特氏菌感染小鼠肠道时,影响其细胞过程、新陈代谢等方面。

图6 单核细胞增生性李斯特氏菌tatD 缺失株感染小鼠肠道微生物KEGG 通路差异Figure 6 Differences of KEGG pathway in gut microbial in mice after tatD mutant of L.monocytogenes infection

3 讨论与结论

李斯特菌是一种强侵袭性胞内菌,可穿透肠道、血脑和胎盘屏障。自单核细胞增生性李斯特氏菌基因组公布后,大量毒力相关基因已被发掘,并已深入探讨其在单核细胞增生性李斯特氏菌致病性方面的作用[10]。作为重要的效应蛋白转运系统,Tat 系统在单核细胞增生性李斯特氏菌穿越宿主肠道屏障过程发挥何种作用仍不清楚。因此,在本研究前期获得单核细胞增生性李斯特氏菌缺失菌株LM10403sΔtatD的基础上进一步探究其口服感染小鼠的毒力,同时采用高通量测序的方法观察其对小鼠肠道菌群的影响。

毒力是微生物对宿主造成损害的相对能力,更是微生物得以在宿主体内传播的主要因素之一[11]。单核细胞增生李斯特氏菌感染过程中,包括Tat 分泌系统在内的转运系统调控释放大量效应蛋白[12]。ZHANG 等[13]将化脓隐秘杆菌Trueperellapyogenes菌株tatD基因敲除后,缺失菌株在小鼠脾脏的细菌载量以及毒力明显较低。本研究也观察到了单核细胞增生性李斯特氏菌tatD基因缺失后,口服感染小鼠的LD50由1.23×107CFU 降为8.11×107CFU。JHELUM 等[14]也发现:tatD基因缺失的肺炎链球菌Streptococcuspneumoniae在肺、血液和脾脏中负荷的细菌较少,并且对肺脏的病理损伤也较小,证实了tatD基因缺失后肺炎球菌毒性降低。NrfC 和NapG 蛋白属于铁硫蛋白,铁硫蛋白家族中的其他成员在促进细菌代谢中发挥了重要的作用,并能促进细菌在更严酷的环境中得以生存[15-16],这2 个蛋白在野生型菌株中迅速降解,但MATOS 等[16]将大肠埃希菌EscherichiacoliMC4100 菌株的tatD基因敲除后,发现NrfC 和NapG 蛋白在tatD基因缺失菌株中高度稳定。因此,这也有助于理解tatD基因缺失后,单核细胞增生性李斯特氏菌的毒力下降不大,但这种现象还需进一步研究证实。

尹诗恒等[17]为探究松材线虫Bursaphelenchusxylophilus侵染下,松干、松针与根系部位内生细菌菌群的影响,选用高通量测序方法来进行研究。本研究同样采用高通量测序的方法探究单核细胞增生性李斯特氏菌tatD基因缺失对小鼠肠道菌群的影响。肠道菌群测序显示:各处理组小鼠肠道菌群的物种均匀度相差不大,但亲本菌株感染小鼠时肠道菌群的丰富度显著降低。动物肠道中的细菌门主要有厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门[18]。厚壁菌门是肠道菌群中的一个优势菌门,且其中包含许多有益菌,例如:芽孢杆菌属Bacillus、肠球菌属Enterococcus、乳杆菌属和乳球菌属Lactococcus等[19]。在门水平上,LM10403sΔtatD处理组的厚壁菌门丰度明显高于LM10403s 和LM10403sCΔtatD处理组。乳酸菌是公认的安全食品级微生物,在食物发酵和益生菌的应用中发挥着重要作用[20]。服用乳酸菌制剂的人群与其他人群相比,具有肠道屏障功能增强、肠道菌群平衡、炎症消散加快和免疫力增强等特征[21],表明乳酸菌具有治疗肠道功能紊乱、维持肠道菌群平衡和抵御肠道致病菌等多种作用。在门水平上,LM10403sΔtatD组与PBS 处理组的厚壁菌门差异不大。但厚壁菌门包含许多菌属,进一步属水平分析单核细胞增生性李斯特氏菌tatD基因缺失感染对小鼠肠道菌群的影响。LM10403sΔtatD处理乳杆菌属相对丰度为20%,显著高于LM10403s 和LM10403sCΔtatD处理组。因此,tatD基因缺失使单核细胞增生性李斯特氏菌感染的小鼠肠道菌群中有益菌增加。KEGG 功能预测发现:LM10403sΔtatD和PBS 处理组与6 类生物代谢通路相关性较低,而LM10403s 处理组与6 类生物代谢通路相关性较高。因此,tatD基因可能直接或间接参与细胞过程和环境信息处理等信号通路。

综上所述,本研究发现单核细胞增生性李斯特氏菌tatD缺失菌株感染小鼠毒力较亲本菌株明显下降,并且有较好的免疫保护效力。单核细胞增生性李斯特氏菌tatD基因缺失感染小鼠后,肠道菌群多样性高于亲本菌株,且有益菌增加。同时,发现tatD基因可能直接或间接参与细胞过程和环境信息处理等信号通路。

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